Inverted Motility Assay:固定化されたアクチンフィラメント上のミオシンの動きを可視化するためのIn Vitro技術

モータータンパク質であるミオシンは、糸状タンパク質であるアクチンと相互作用する球状頭部ドメインを持っています。この相互作用は、アクチンフィラメントに沿ったミオシンの転座に不可欠です。この結合をin vitroで研究するには、表面に繋がれたアクチン上でミオシンの逆運動性アッセイを実行します。

まず、ビオチン化ポリエチレングリコール - PEGコーティングされたカバーガラスを顕微鏡スライドの上に置き、コーティングされた表面が内側を向くようにして、チャンバーの上部を作成して、アッセイチャンバーを組み立てます。

アビジン(糖タンパク質)を含む溶液をチャンバーに通します。アビジンはビオチンに高い親和性で結合し、アクチンの接着を高めます。次に、赤色蛍光色素で標識されたビオチンタグ付きアクチンフィラメントを流します。ビオチンリガンドはアビジンに結合し、カバーガラス表面のフィラメントを固定します。

最後に、緑色の蛍光タンパク質標識ミオシン5Aタンパク質をアデノシン三リン酸(ATP)分子を含むバッファーに加えます。トレーリングヘッドとリーディングヘッドを含むデュアルヘッドミオシン5Aは、固定化されたアクチンフィラメントと相互作用します。ミオシンの後続の頭部はATPに結合し、アクチンから分離します。

ATPの加水分解によりパワーストロークが発生し、トレーリングヘッドがフィラメントに沿ってリーディングヘッドの前の位置に結合できるようになります。連続したパワーストロークにより、ミオシンは剥離することなく固定化されたアクチンフィラメントに沿って移動します。

蛍光顕微鏡を使用して、赤色アクチンフィラメント上の緑色のミオシン分子の動きを記録します。

ミオシン5a逆運動性アッセイ用の溶液を調製し、氷上に置いておく。

DTTで10マイクロリットルの運動性バッファーでチャンバーを洗浄します。DTTを使用した運動性バッファー中の1ミリリットルあたり1ミリグラムのBSAの10マイクロリットルの流れ。これを2回繰り返し、3回目の洗浄から1分待ちます。ティッシュまたはろ紙を使用して、フローチャンバーの出口に紙の角をそっと置き、溶液をチャネルから吸い上げます。

次に、チャンバーを10マイクロリットルの運動性バッファーでDTTで3回洗浄します。DTTを含む運動性バッファーに10マイクロリットルのNeutrAvidin溶液を流し、1分間待ちます。次に、10マイクロリットルのその溶液で3回洗浄します。

10マイクロリットルのbRh-アクチン含有運動性バッファーをDTTとともに、大きな穴のピペットチップを使用して流し、1分間待ちます。次に、10マイクロリットルの運動性バッファーでDTTで3回洗浄します。

10ナノモルのミオシン5aを含む30マイクロリットルの最終バッファーを流し、すぐに全反射蛍光顕微鏡にロードします。TIRFイメージングに最適な焦点が見つかったら、記録を開始します。