ATPベースのルシフェラーゼ生存率アッセイ:腫瘍オルガノイド上の試験剤の成長阻害能を評価するための均質な方法

主要な細胞エネルギー源であるアデノシン三リン酸 ATP は、さまざまな細胞機能に不可欠です。ストレス下では、細胞内ATPレベルが悪影響を受けるため、ATPは代謝活性で生存可能な細胞の優れたマーカーになります。

まず、腫瘍細胞懸濁液を黒壁の透明な底のマイクロプレートに播種し、光強度測定中の光散乱を最小限に抑えます。マイクロプレートは、細胞がプレートに付着するのを防ぐハイドロゲルコーティングで構成されており、細胞間の相互作用と腫瘍オルガノイド(腫瘍微小環境を模倣した三次元組織培養物)への自己組織化を可能にします。

次に、試験化合物で処理します。試験化合物はオルガノイド細胞と相互作用し、その増殖阻害の可能性によっては、エネルギー産生代謝プロセスを混乱させ、細胞内ATPの枯渇を引き起こす可能性があります。

処理後、界面活性剤、ATPアーゼ阻害剤、酵素ルシフェラーゼ、ルシフェラーゼ特異的基質、ルシフェリン、マグネシウムイオンを含むワンステップ試薬を追加します。所望の期間インキュベートします。

界面活性剤は細胞膜を可溶化し、細胞溶解と溶液へのATP抽出を引き起こし、ATPアーゼ阻害剤は放出された内因性ATPアーゼを不活性化し、ATPを安定させます。

抽出後、ATPはマグネシウムイオンの存在下でルシフェリンがルシフェラーゼに結合することを促進し、ルシフェリンはルシフェリンを高エネルギーのオキシルシフェリンに酸化し、弛緩すると生物発光光子を生成します。

ルミノメーターを使用して、細胞内ATP濃度を表す光子によって生成される光強度を測定します。ATP の量が少ないほど、細胞生存率が低いことを示し、試験化合物の増殖阻害の可能性が高いことを示唆しています。

培地を24時間交換した後、70マイクロメートルのメッシュフィルターを含むフィルターホルダーを備えた細胞断片化分散装置を使用して腫瘍オルガノイドをみじん切りにします。15ミリメートルの腫瘍オルガノイド懸濁液を10倍に希釈します。

細胞懸濁液ディスペンサーを使用して、40マイクロリットルの希釈腫瘍オルガノイド懸濁液を384ウェルの超低付着スフェロイドマイクロプレートに播種します。

24時間後、リキッドハンドラーを使用して、20マイクロモルから1.0ナノモルの最終濃度範囲で10回の連続希釈液から0.04マイクロリットルの試験薬溶液をウェルに加え、プレートを6日間インキュベートします。

インキュベーションの最後に、細胞内ATP測定試薬をテストウェルに加えます。ミキサーを使用してプレートの内容物を混合し、プレートを摂氏約25度で10分間インキュベートします。プレートリーダーを使用して、細胞内ATP含有量を発光として測定します。