JoVE 実験百科事典
生物学的技法
0 回視聴 • 3:28 分 • July 8th, 2025
腸オルガノイドは、死んだ細胞と破片からなる中央内腔を持つ腸のような陰窩絨毛組織を再現します。内腔は絨毛のような細胞と、幹細胞を宿した出芽した陰窩のような突起で覆われています。
オルガノイド細胞が異なれば、代謝活動の副産物であるROSは、代謝活動の副産物である活性酸素種を産生し、その蓄積は酸化ストレスを引き起こします。
さまざまな細胞の酸化ストレスを視覚化するには、まず、培養した3Dオルガノイドを含むマルチウェルプレートを基底マトリックスに採取します。オルガノイド幹細胞は、イメージング中にそれらを区別するのに役立つ緑色の蛍光タンパク質またはGFPタグ付きタンパク質を発現します。
ウェルにtert-ブチルヒドロペルオキシド(ROS誘導剤)を補充し、インキュベートします。誘導剤は膜結合NADPHオキシダーゼを活性化し、細胞内のROS産生を刺激します。幹細胞は代謝が活発であるため、分化した細胞よりも多くのROSを産生します。
ROS感受性蛍光プローブを追加します。これらの親油性プローブは細胞に急速に入り込み、ROSと反応して赤色蛍光を発します。オルガノイドを生細胞核を選択的に染色するHoechst色素で処理します。共焦点顕微鏡を使用してオルガノイドを画像化します。
染色された核を持つ周辺のオルガノイド細胞は、GFP発現幹細胞では高く、分化した細胞では低く、さまざまな程度の赤色蛍光を示します。本質的にROSレベルが高い死細胞は、内腔で赤色蛍光を示します。
赤色蛍光の強度は、さまざまな細胞型における酸化ストレスのさまざまなレベルと相関しています。
共焦点顕微鏡で酸化ストレスを視覚化するには、オルガノイドをプレーティングしたマイクロスライド8ウェルチャンバーの対応するウェルに1マイクロリットルのN-アセチルシステインストック溶液を加えます。
1時間のインキュベーション後、1マイクロリットルのTert-ブチルヒドロペルオキシド原液を対応するウェルに加え、さらに30分間インキュベートします。次に、ウェルあたり蛍光プローブの1.25ミリモル希釈液を1マイクロリットル加え、続いて1ミリリットルあたり1.25ミリグラムのヘクスト溶液を1マイクロリットル加えます。
さらに30分間のインキュベーション後、BMMを乱さずに培地を取り出し、フェノールレッドを含まない250マイクロリットルの温かいDMEMをそっと加えます。
蛍光プローブを検出するサーミックチャンバーとガス供給を備えた共焦点顕微鏡を使用してオルガノイドを画像化します。
ポジティブコントロールを使用して、ROS信号のレーザー強度と時間露光を設定し、この信号がネガティブコントロールで低いことを確認します。次に、接眼レンズを使用してスライドをスクリーニングしてGFPを発現するオルガノイドを特定し、レーザー強度を調整します。
25マイクロメートルのzスタックを設定し、位置を定義してオルガノイド全体のステッチ画像を取得し、細胞の1つの層を示すオルガノイドのセクションを取得します。