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腸細胞は活性酸素種であるROSを生成します。中程度の ROS レベルは細胞恒常性を維持しますが、ROS レベルが高いと細胞死を引き起こす可能性があります。
in vitroでROSレベルを定量するには、マウス腸管3Dオルガノイドの培養から始めます。これらのオルガノイドは、緑色の蛍光発現幹細胞を保有する陰窩状突起を持つ腸上皮構造を示します。それらはまた、死んだ細胞と破片からなる中央内腔を取り囲む、周辺に絨毛様の分化細胞を含んでいます。これらの細胞はすべて、異なるレベルのROSを生成します。
次に、指定されたウェル内のオルガノイドをROSモジュレーターで処理します。その性質に基づいて、モジュレーターはROS誘導剤または阻害剤として作用する可能性があります。必要な時間インキュベートした後、使用済み培地を取り除きます。
タンパク質分解酵素を培養物に添加すると、オルガノイドの3D構造が破壊され、懸濁中のさまざまな細胞が放出されます。次に、ROS感受性蛍光プローブを加えてインキュベートします。
細胞に入ると、プローブはROSと反応し、酸化されて赤色蛍光を発します。死んだ細胞の核を選択的に染色するDNA結合蛍光色素であるDAPIで細胞を処理し、生細胞とのコントラストを作成します。
フローサイトメーターを使用して、DAPI陰性の生細胞を分析し、ROSレベルに対応する赤色蛍光シグナルを取得します。モジュレーターの性質に応じて、誘導剤はROSレベルを上昇させ、阻害剤はROSレベルを低下させます。
オルガノイドを含む96ウェル丸底プレートのネガティブコントロールウェルに1マイクロリットルのN-アセチルシステインストック溶液を加えます。
1時間のインキュベーション後、1マイクロリットルのTert-ブチルヒドロペルオキシドストック溶液を対応するウェルに加え、30分間インキュベートします。次に、マルチチャンネルピペットを使用して、取り付けられたBMMを乱すことなく培地を除去し、別の96ウェル丸底プレートに移します。このプレートは脇に置いておいてください。
次に、100マイクロリットルのトリプシンを加え、マルチチャンネルピペットを使用して、上下に5回ピペットを動かしてBMMを破壊します。5分間の短いインキュベーションの後、2回目のピペッティングを上下にピペッティングしてオルガノイドを解離します。
プレートを回転させ、プレートを反転させて上清を捨てます。以前に別の96ウェルプレートに集めた培地を対応するウェルに戻し、上下に5回ピペッティングして細胞を再懸濁します。
次に、1マイクロリットルの蛍光プローブを加え、30分間インキュベートします。次に、プレートを再度回転させ、250マイクロリットルのDAPI溶液で細胞を再懸濁します。サンプルをフローサイトメトリーチューブに移し、チューブを氷上に置いてください。
モノ染色サンプルを使用して、各蛍光色素について、未染色の制御電圧とレーザー電圧の順方向および側面散乱電圧設定を最適化します。次に、適切なゲーティング戦略を使用して、最低 20,000 個のイベントを収集します。