SUMO化アッセイ:イムノブロッティングにより基質タンパク質のSUM化状態を検出するIn vitro技術

SUMO化は、小さなユビキチン様修飾因子であるSUMOが基質タンパク質に結合することによって発生します。

SUMO化は、成熟したSUMOペプチドが酵素E1によって活性化されるときに発生します。活性化すると、SUMOは結合酵素の活性部位であるE2に移され、SUMOを基質タンパク質のリジン残基に結合します。別のリガーゼであるE3は、この相互作用の効率を高めます。

vitro SUMO化アッセイを実行するには、基質タンパク質(p53)、酵素、およびSUMOペプチドの混合物を含むチューブから始めて、インキュベートしてSUMO化を誘導します。チューブにドデシル硫酸ナトリウム(SDS含有緩衝液)を補充し、反応を終了します。サンプルを加熱してタンパク質を変性させます。

タンパク質混合物をSDS-PAGEゲルのウェルにロードし、電気泳動を行います。高分子量のSUMO化タンパク質は、非SUMO化バリアントよりも移動が遅く、2つの異なるバンドを生成します。

エレクトロブロッティング装置の湿ったろ紙上に存在するブロッティングメンブレンにゲルを転写します。湿ったろ紙で覆い、タンパク質をゲルからメンブレンに電気転写します。

p53に結合する抗p53抗体で膜を処理します。抗体-p53複合体に結合する酵素結合二次抗体と重ね合わせます。化学発光基板を加えて発光生成物を生成し、膜を画像化します。

高分子量バンドはSUMO化タンパク質に対応し、低バンドは非SUMO化タンパク質変異体

vitro SUMOylationマスターミックス反応で、精製されたタグ-K-bZIPのマイクロリットルあたり100ナノグラムの3マイクロリットルを追加します。次に、マスターミックスの内容物を穏やかに混合し、摂氏30度で3時間インキュベートします。

次に、20マイクロリットルの2x SDS-PAGEをローディングバッファーとともに添加して反応を停止します。次に、サンプルを摂氏95度で5分間加熱してタンパク質を変性させます。

次に、20マイクロリットルのサンプルを10%SDS-PAGEゲルにロードし、染料がゲルの底に到達するまでゲルを80ボルトで約120分間実行します。

電気泳動が終了したら、ゲル装置を外し、ゲルをセミドライ転写バッファーに5分間転写します。次に、メタノールで満たされた別の容器にPVDFメンブレンを1分間

メタノールからPVDF膜を取り除き、半乾式転写バッファーに浸します。次に、膜を5分間穏やかにかき混

セミドライ電気泳動装置の安全カバーを取り外します。ろ紙を事前に濡らし、白金陽極の底にゲルサンドイッチを準備します。カソードプレートを安全カバーに固定した後、ブロットを15ボルトの定電流で90分間実行します。次に、セミドライ装置を取り外した後、電源を切り、PVDFメンブレンを取り出します。

次に、ブロッキングバッファーでPVDFメンブレンをブロッキングバッファーで、室温で毎分30回転で1時間ブロックします。次に、PVDFメンブレンを抗p53抗体およびブロッキングバッファーと、摂氏4度で12〜16時間、毎分30回転の懸濁ミキサーでハイブリダイズします。

次に、PVDFメンブレンを取り出し、Tween-20を含むTRIS緩衝生理食塩水で満たされた容器に移します。次に、PVDFメンブレンをTween-20を含むTRIS緩衝生理食塩水にオービタルシェーカー上で毎分45回転で30分間浸します。次に、ブロッキングバッファーで希釈した西洋わさびペルオキシダーゼと結合した抗ウサギ抗体とPVDF膜を、室温で毎分30回転の懸濁ミキサーで1時間ハイブリダイズします。

次に、PVDFメンブレンをTween-20でTRIS緩衝生理食塩水で3回洗浄します。洗浄後、PVDFメンブレンをTRIS緩衝生理食塩水Tween-20に30分間、懸濁ミキサー上で毎分45回転で浸します。次に、TRIS緩衝生理食塩水Tween-20をリン酸緩衝生理食塩水に置き換えて、PVDF膜を摂氏4度で最大12時間保存します。

次に、強化化学発光基質試薬1と2を1:1の比率で混合します。次に、リン酸緩衝生理食塩水からPVDFメンブレンを取り除き、パンチポケットで短時間ブロットして余分な水分を吸収します。

すぐに、400マイクロリットルの化学発光試薬を膜表面に加え、3〜5分間待ちます。短時間ブロットして余分な化学発光試薬を排出し、メンブレンが完全に乾燥するのを防ぎます。発光イメージングシステムを使用してブロットを露出します。