蛍光マイクロプレートベースのシクロヘキシミドChaseアッセイ:蛍光核ミスフォールドタンパク質の分解速度を監視する技術

定義された三次構造を欠く核ミスフォールドタンパク質には、小さなユビキチン様修飾因子、SUMO、およびユビキチン分子がタグ付けされており、ユビキチン-プロテアソームシステムであるUPSを含むタンパク質分解システムによる分解

を促進します。

いくつかの神経変性疾患では、UPS 機能不全により、核の誤って折りたたまれたタンパク質の蓄積と凝集が引き起こされ、神経細胞死につながります。

in vitroで核ミスフォールドタンパク質の分解速度を調べるには、蛍光標識ミスフォールドタンパク質をコードするプラスミドDNAとトランスフェクション試薬を含む混合物で接着哺乳類細胞の培養物を処理します。

トランスフェクトに成功した細胞は、核局在シグナルでタグ付けされた蛍光標識された短い半減期のミスフォールドタンパク質を発現します。核に輸送されると、これらの誤って折りたたまれたタンパク質は SUMO 化とユビキチン化を受け、タンパク質の分解とクリアランスのために UPS に移されます。

インキュベーション後、培地をシクロヘキシミドを含む低蛍光培地と交換します。細胞透過性分子であるシクロヘキシミドは、大きなリボソーム単位に結合し、タンパク質翻訳の伸長段階とさらなるタンパク質合成をブロックし、蛍光標識翻訳されたミスフォールドタンパク質の分解速度の研究を促進します。

一連の

ウェルをプロテアソーム阻害剤で処理して、プロテアソーム活性をブロックし、誤って折りたたまれたタンパク質を蓄積させます。マイクロプレートリーダーを使用して、誤って折りたたまれたタンパク質の蛍光を測定します。

蛍光の時間依存的な低下は、誤って折りたたまれたタンパク質の分解を示します。プロテアソーム阻害剤で処理された細胞は、時間の経過とともに同様の蛍光強度を示し、誤って折りたたまれたタンパク質分解の阻害を示します。

テキストプロトコルに従ってHeLa細胞を96ウェルプレートに播種し、トランスフェクションした後。トランスフェクションの20〜24時間後に、細胞のGFP発現を調べます。培地を約200マイクロリットルの1x PBSで各ウェルに除去し、吸引して残留DMEMを除去します。

5%FBSを含む60マイクロリットルの低蛍光DMEMと、1ミリリットルあたり50マイクログラムのシクロヘキシミドを加え、1セットのサンプルに10マイクロモルのMG132を加えます。

蛍光プレートリーダーを使用して、プレートを読み取るGFPシグナルを最大8〜10時間1時間ごとに測定します。データをエクスポートし、テキストプロトコルに従って統計分析を実行します。