ルシフェラーゼアッセイ:人工ナノルシフェラーゼシステムベースのバイオレポーターを使用して発光シグナルを測定するハイスループットアッセイ

ルシフェラーゼは、その基質を酸化して生物発光生成物を形成する酵素です。

ルシフェラーゼのこの特性は、酵素の分割バージョンが使用されるナノルシフェラーゼベースのレポーターシステムの設計に役立ちます。このシステムでは、小さなフラグメントと大きなフラグメントは互いに高い結合親和性を持ち、機能性酵素を再構成することができます。

ターゲットタンパク質(SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質の受容体結合ドメイン)を検出するためにナノルシフェラーゼベースのシステムを使用するには、接着細胞を含む培養皿から始めます。これらの細胞には、標的タンパク質をコードするプラスミドと、操作されたナノルシフェラーゼの小さなフラグメントに特異的な配列が含まれています。

発現すると、培養細胞はバイオレポーター(ルシフェラーゼの小さなフラグメントと融合した組換え標的タンパク質)を産生します。細胞を溶解バッファーで処理し、攪拌下でインキュベートします。バッファー成分は細胞を急速に溶解し、バイオレポーターを含む細胞内容物を上清に放出します。

上清をマルチウェルアッセイプレートに移します。分割ナノルシフェラーゼの大きなフラグメントを含む溶液を各ウェルに補充し、インキュベートします。

インキュベーション中、大きなフラグメントはバイオレポーターの小さなサブユニットと自発的に結合し、機能的コンフォメーションを達成します。基質であるフリマジンを含む溶液を加え、アッセイプレートをルミノメーターに入れます。

機能性酵素がフリマジンを酸化し、明るい発光信号を発します。シグニチュードの大きさは、ターゲットタンパク質濃度と相関します。

ルシフェラーゼアッセイを使用してバイオレポーターからの発光シグナルを評価するには、まず反応成分を調製し、上清をバイオレポーターの供給源として使用します。

使用前にLgBiTと基質を1倍に希釈してください。50マイクロリットルの上清を各ウェルまたはチューブから96ウェルプレートに移し、50マイクロリットルの1x LgBiTを各ウェルに加えます。室温で5分間インキュベートします。

ルミノメーターソフトウェアを開きます。各ウェルに50マイクロリットルの1x基質を追加します。プレートをルミノメーターに置き、ソフトウェアを実行します。