細胞ベースのAAV中和抗体アッセイ:血清中の特定のアデノ随伴ウイルスに対する中和抗体を検出するための比色技術

組

換えアデノ随伴ウイルス、rAAV、遺伝子操作された非エンベロープ一本鎖DNAウイルスは、有望な治療用遺伝子キャリアです。

rAAVは標的細胞膜受容体に付着し、クラスリンを介したエンドサイトーシスを受け、rAAVゲノムの核送達と治療遺伝子発現を促進します。しかし、rAAVに対する中和免疫系抗体は、特定のrAAVエピトープに結合し、細胞膜結合、細胞侵入、遺伝子導入を妨

害します。

羊血清中の特定の rAAV に対する中和抗体を検出するには、まず、適切な濃度の希釈血清を取得します。ヒト胎盤アルカリホスファターゼ、hPLAP、遺伝子を発現する組換えAAVを追加します。中和抗体がAAVに結合して中和できるようにします。

この混合物を、接着ヒト上皮細胞培養物を含むマルチウェルプレートのウェルに移します。インキュベーション時に、AAVは細胞エンドサイトーシスを受けます。形質導入された細胞は、細胞膜結合hPLAPを発現します。ただし、中和されたAAVは細胞に入ることができません。

ウェルから培地を廃棄します。パラホルムアルデヒドを使用して細胞を固定します。予熱したバッファーを加え、細胞を加熱して内因性細胞アルカリホスファターゼを不活性化します。hPLAPは熱不活化に強いです。

hPLAP基質(ブロモクロロインドリルリン酸、BCIP、およびニトロブルーテトラゾリウム、NBT)を加えます。hPLAPはBCIPを脱リン酸化し、BCIPは二量体化を受け、青色の中間体を形成します。放出された水素イオンはNBTを還元し、不溶性の紫色の沈殿物を生成します。形質導入された細胞の周囲の紫色の沈着物を観察するための画像。

紫色の領域の割合が低いほど、AAV中和抗体の濃度が高いことを示唆しています。

予

熱した完全DMEM培地で細胞を1 x 10 5細胞/mLの濃度に希釈することにより、HT1080細胞のプレーティングを初日に開始します。

次に、ウェルあたり100マイクロリットルの細胞を、ウェルあたり1 x 10⁴細胞の濃度の透明な96ウェル平底プレートに播種します。プレートを摂氏37度で5%二酸化炭素とともに一晩16〜22時間インキュベートします。

2日目に、予熱した完全DMEMを使用して、1.5ミリリットルの微量遠心チューブで目的の血清サンプルの連続希釈液を生成します。

希

釈した血清サンプルを含む各チューブに、マイクロリットルあたり 66 マイクロリットルの 7.5 x 10⁶ ウイルスゲノムをウイルス作業溶液に加えます。ウイルス/血清希釈液をピペッティングで混合し、ウイルス/血清混合物を含むチューブを摂氏37度のインキュベーターに5%二酸化炭素で30分間入れ、中和の可能性を許容します。

30分後、100マイクロリットルのウイルス/血清混合物を、ウェルあたり1 x 10⁴細胞を含む96ウェルプ