In vitro Persister Assay:細菌の持続性に対する浸透圧の影響を評価する方法

有害な環境条件にさらされると、細菌のサブセットは代謝活性が低い状態になり、有害な影響を回避します。持続性物質と呼ばれるこれらの細菌は、高濃度の抗生物質への一時的な曝露に耐えることができます。

浸透圧 (小さな有機溶質) が細菌の持続性に及ぼす影響を研究するには、まず、培地中に懸濁して検出限界を下回る既存の持続性剤を含む指数関数的段階の細菌細胞培養物を取得します。

次に、懸濁液をマイクロアレイプレートの浸透圧を含むウェルに移します。浸透圧をコントロールとして使用しないウェルのセットを保管してください。プレートをガス透過性メンブレンで密閉し、細胞増殖とインキュベーションのための急速なガス拡散を可能にします。

適切な濃度の培地中の浸透圧は浸透圧ストレスを誘発し、一部の細胞が細胞代謝を急速な成長から遅い成長に再プログラムし、持続性を形成します。

次に、浸透圧処理細胞と対照細胞を抗生物質を含む持続性アッセイプレートに移します。パーシスタントアッセイプレートを密封し、インキュベートします。

抗生物質の存在下では、正常な細胞は細胞死を起こしますが、抗生物質耐性である持続性細胞は生き残ります。最後に、細胞のごく一部を集め、緩衝液で連続希釈し、抗生物質を含まない寒天プレートにスポットします。プレートをインキュベートします。

抗生物質がない場合、持続性は成長を再開して増殖し、コロニーを形成します。寒天プレート上のコロニーの数を数えます。

抗生物質治療後の無浸透圧コントロールよりもコロニーの数が多いことは、持続性剤の形成に対する浸透圧のプラスの効果を示唆しています。

まず、マイクロアレイ細胞培養物を調製します。

250マイクロリットルの指数相細胞を、50ミリリットルの遠心分離管で25ミリリットルの新鮮な修飾LB培地に移します。次に、細胞懸濁液を穏やかに混合して均一にします。

希

釈した細胞懸濁液を滅菌50ミリリットルのリザーバーに移します。マルチチャンネルピペットを使用して、150マイクロリットルの細胞懸濁液を、さまざまな化学物質を含むマイクロアレイプレートの各ウェルに移します。マイクロアレイは、テキスト原稿に記載されている方法に従って、手動で生成することもできます。

マイクロアレイプレートをガス透過性のシーリングメンブレンで覆い、摂氏37度、250 RPMのオービタルシェーカーで24時間インキュベートします。

Persisterアッセイプレートを作成するには、50ミリリットルの遠心分離管に5ミリリットルのオフロキサシンを含む25ミリリットルの修飾LB培地を調製し、この培地を滅菌リザーバーに移します。

190マイクロリットルの修飾LB培地を、一般的な平底96ウェルプレートの各ウェルに移します。24時間のインキュベーション後、マイクロアレイをシェーカーから取り出し、10マイクロリット