蛍光レポーターベースの麻痺アッセイ:線虫Caenorhabditis elegansにおけるポリグルタミン蛍光レポーターの加齢に伴う進行性形成と関連麻痺を評価する技術

細胞タンパク質恒常性、またはプロテオスタシスには、誤って折りたたまれたタンパク質の分解とともに、タンパク質の折り畳みと機能の調節が含まれます。老化すると、プロテオスタシス機構が低下し、誤って折りたたまれたタンパク質が蓄積してさらに凝集し、細胞機能障害を引き起こします。

加齢に伴うプロテオスタシスの低下を判断するには、発生的に同期した成体のトランスジェニックCaenorhabditis elegansから始めます。

これらのワームの筋細胞は、蛍光タグと融合した異常に拡張したポリグルタミン(polyQ)リピートでタンパク質を発現します。PolyQタンパク質はミスフォールディングを起こしやすいため、蓄積すると凝集体を形成する可能性があります。

ワームをアガロースパッドを含む顕微鏡スライドに移し、生細胞イメージングに適した化学物質で固定化します。蛍光顕微鏡を使用して、ワームの体壁の筋肉を一定期間にわたって視覚化し、蛍光polyQ凝集体に対応する明るい蛍光病巣シグナルを決定します。

数日以内に、加齢に伴うタンパク質静態の低下により、進行性のポリQ凝集体の蓄積が起こり、蛍光病巣の数が増加します。筋細胞内のポリQ凝集体の増加は、毒性を引き起こし、筋細胞の機能を破壊し、麻痺を引き起こします。

顕微鏡下で、機械的刺激を受けても動きのない生きた麻痺したワームの数を記録します。ワーム麻痺率の増加は、ワームの筋肉組織における加齢に伴うプロテオスタシスの低下を示唆しています。

筋肉組織のプロテオスタシスの低下を測定するには、20匹の動物を選び、3%アガロースパッドと5マイクロリットルの10ミリモルアジ化ナトリウム滴を含む顕微鏡スライドに取り付けます。

すべてのワームを固定した後、10倍のレンズを使用して動物の全身を画像化します。すべての動物にFITCまたはYFPフィルターを使用し、同じ露出を使用します。終了したら、スライドを廃棄します。

動物全体の体壁の筋肉の病巣の数を数えます。病巣は、バックグラウンドのより暗い可溶性信号と区別できる、より明るく中断された信号です。

採点日には、動物の入ったプレートを見て、麻痺した動物の数を記録します。次に、麻痺した動物をプレートから取り除きます。

実験終了時に、各条件の麻痺率を計算し、麻痺の進行をプロットします。