Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay:タンパク質間相互作用を阻害する小分子をスクリーニングするためのビーズベースの近接アッセイ

生物学的システムでは、タンパク質が特定のパートナーに近接していることは、タンパク質間相互作用が成功するかどうかの重要な決定要因です。小さな阻害分子が存在すると、これらのタンパク質は互いに近づくことができず、相互作用が妨

2つのタンパク質(シャペロンとコシャペロン)間の相互作用を阻害する阻害分子をスクリーニングするには、さまざまな小分子を含むマルチウェルプレートを取ります。ウェルの表面にコシャペロンが取り付けられたドナービーズでウェルを補います。これらのビーズには、化学発光アッセイ用の光増感剤が含まれています。

コシャペロンに特異的に結合するシャペロン由来ペプチド配列に結合したアクセプタービーズのスラリーを追加します。ビーズには、チオキセンベースの色素と視覚化に不可欠な蛍光色素が含まれています。

非阻害性分子を含むウェルでは、シャペロン結合ペプチドとコシャペロンの間の高い親和性がアクセプタービーズとドナービーズを引き付けます。阻害剤が存在する場合、ビーズは遠くに残ります。

化学発光リーダーを使用して、相互作用を調べます。特定の波長で照射されると、ドナービーズ光増感剤は反応性の高い一重項酸素を放出します。

阻害分子がないため、放出された種は近位に配置されたアクセプタービーズの近くに到達し、色素分子と反応して化学発光を引き起こします。このエネルギーはアクセプタービーズの蛍光色素を活性化し、発光を引き起こします。

対照的に、阻害分子を含むウェルでは、一重項酸素が崩壊し、発光がなくなり、タンパク質間相互作用の阻害に成功したことを示しています。

グルタチオンドナービーズを10マイクログラム/ミリリットル濃度のPBSに加えます。GST-FKBP51を10マイクログラム/ミリリットルの最終濃度まで添加し、暗所で摂氏25度で10分間反応をインキュベートします。

DMSOで試験化合物を連続希釈します。0.25マイクロリットルの試験化合物希釈液を384ウェルプレートの各ウェルの隅に3回追加します。

ネガティブコントロールの場合は0.25マイクロリットルのDMSOを追加し、ポジティブコントロールの場合は、0.25マイクロリットルのHsp90 C末端ペプチドをウェルに加えます。

GSTタグ付きタンパク質を含むグルタチオンドナービーズを含む溶液22.5マイクロリットルを各ウェルに加えます。プレートを手でよく振って、25°Cの暗所で15分間インキュベートします。

付属したHsp90 C末端ペプチドでアクセプタービーズを0.5x PBS中で100マイクログラム/ミリリットル濃度に希釈します。2.25マイクロリットルの希釈アクセプタービーズを各ウェルに加えます。示されているように、プレートを振とうして暗所で15分間インキュベートします。

プレートリーダー機器の電源を入れ、プレートの信号を測定し、テキスト原稿に記載されているようにデータを分析します。