JoVE 実験百科事典
生物学的技法
0 回視聴 • 5:32 分 • July 8th, 2025
微生物病原体に感染した宿主細胞は、アポトーシス - プログラムされた細胞死を起こします。アポトーシス中、DNase は染色体 DNA を小さな断片に分解し、細胞死を引き起こします。
TUNELアッセイを使用してアポトーシスを検出するには、真菌病原体に感染した脱パラフィン化および再水和された皮膚組織切片を含むスライドガラスを取ります。
組織をプロテイナーゼ-Kで処理して細胞DNaseを不活性化し、分析中にDNAを分解する可能性を防ぎます。過酸化水素を加えて反応を消し、スライドを洗浄して未反応のプロテイナーゼ-Kを除去します。
ジゴキシゲニン標識デオキシウリジン三リン酸塩(dUTP)を含むバッファーを追加します。末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、TdT酵素を補充し、インキュベートします。アポトーシス細胞では、TdT酵素は、断片化されたDNAの露出した3'-ヒドロキシル基への標識dUTPの付着を触媒します。
次に、ローダミンレポーターに結合した抗ジゴキシゲニン抗体を加え、暗所でインキュベートして、ジゴキシゲニン標識dUTPへの抗体結合を促進し、イメージング時に赤色蛍光を与えます。
組織サンプルを蛍光核対比染色で処理し、核を視覚化します。組織切片の上にカバーガラスを置き、蛍光顕微鏡で視覚化します。
青色蛍光は組織切片内のすべての細胞の核を識別するのに役立ち、ローダミン染色細胞に赤色蛍光が存在することは、アポトーシスによるDNA断片化を示しています。
この手順を開始するには、テキストプロトコルに概説されているように、サンプル組織を含む親水性スライドガラスを準備します。
組織切片を脱パラフィンするには、スライドをキシレンで3回、それぞれ5分間、コプリンジャーで洗浄します。次に、スライドを100%エタノールで2回、それぞれ5分間洗浄します。この後、スライドを95%エタノールと70%エタノールでそれぞれ3分間洗浄し、次にスライドをPBSで5分間1回洗浄します。
実験用およびネガティブコントロールスライドを調製するには、新たに希釈したプロテイナーゼKをスライドに直接添加して組織を前処理します。スライドを室温で10分間インキュベートし、次に、スライドをPBSで2回、それぞれ2分間洗浄します。
ポジティブコントロールスライドを調製するには、組織をDNバッファーで前処理し、スライドを室温で5分間インキュベートします。この後、DNase IをDNバッファーに溶解し、最終濃度0.1マイクログラム/ミリリットルにしました。調製したDNA溶液をスライドに加えます。スライドを室温で15分間インキュベートし、次に、コプリンジャーで蒸留水で側面を5回、それぞれ3分間洗浄します。
PBS中の3%過酸化水素で室温で5分間反応を急冷します。次に、スライドをPBSで2回、それぞれ2分間洗浄します。次に、スライド上の組織に平衡バッファーを追加します。室温で10秒間インキュベートしてから、組織切片の周りの余分な液体を軽くたたきます。
末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素を反応バッファーで希釈し、実験用およびポジティブコントロールスライドの組織に添加します。摂氏37度の加湿チャンバーで1時間インキュベートします。
この後、スライドをストップバッファーの作業濃度を含むコプリンジャーに入れます。15秒間攪拌し、スライドを室温で10分間インキュベートします。次に、スライドをPBSで3回、それぞれ1分間洗浄し、余分な液体を軽くたたきます。
次に、室温に予熱した抗ジゴキシゲニン複合体を組織に直接加えます。スライドを加湿した暗室で室温で30分間インキュベートします。
インキュベーションが完了したら、スライドをPBSで4回、それぞれ2分間洗浄します。余分な液体を軽くたたきます。次に、側面に封入剤を追加します。スライド上の封入剤に15マイクロリットルのDAPI溶液を加えます。各スライドをカバーガラスで覆い、マニキュアで密封します。スライドを暗所で乾燥させます。
蛍光顕微鏡を使用して、染色プロセスが完了したらすぐにスライドを観察します。
各スキンセクションに沿ってランダムな間隔で400回撮影します。DAPIで染色された青色の細胞を数えて、動物ごとに皮膚切片ごとに少なくとも100個の細胞が見えることを確認します。次に、細胞の端がはっきりした赤い単一細胞として現れるTUNEL陽性細胞の数を数えます。