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カスパーゼ-3およびカスパーゼ-7は、標的タンパク質のDEVDテトラペプチド配列を認識し、アスパラギン酸残基のC末端でそれらを切断するプロテアーゼです。これらは、アポトーシス(プログラムされた細胞死)カスケードにおいて重要な役割を果たします。
アポトーシス細胞におけるカスパーゼ-3/7活性を評価するには、アポトーシス誘導真菌に感染したカエルのつま先の皮膚外植片を含むチューブから始めます。チューブに適切なバッファーといくつかの金属ビーズを追加します。
ビーズビートを使用して皮膚細胞を破壊し、カスパーゼ-3/7タンパク質を含む細胞内容物を放出します。チューブを遠心分離し、細胞破片と細胞小器官をペレット化します。タンパク質が豊富な上清をチューブから吸引し、マルチウェルアッセイプレートのウェルにピペットで移します。
ウェルにルミノジェニックカスパーゼ試薬を補充します。この試薬は、ATP、マグネシウムイオン、およびルシフェラーゼ酵素を含む緩衝溶液中にDEVDペプチドを含む発光基質で構成されています。
ウェルの内容物を混ぜてインキュベートします。インキュベーション中、カスパーゼ-3/7はプロルミネセンス基質を切断し、ルシフェラーゼの基質であるアミノルシフェリンを溶液中に放出します。
ATPとマグネシウムイオンの存在下で、ルシフェラーゼは放出されたアミノルシフェリンを酸化し、生物発光生成物を生成します。反応中に生成される光の量は、カスパーゼ活性に比例します。
凍結したカエルのつま先サンプルからタンパク質を抽出するには、100マイクロリットルのサンプルバッファーと2つのステンレス鋼ビーズを含む1.5ミリリットルのスクリューキャップマイクロ遠心チューブにサンプルを入れます。
ビーズビーターを最高速度で使用して細胞を溶解します。この後、チューブを氷の上に3分間置き、チューブを遠心分離して上清を回収します。
384ウェルプレートでカスパーゼ3/7アッセイを実行するには、10マイクロリットルのサンプルバッファーをブランクとして、10マイクロリットルのタンパク質抽出物を3回ずつ加えます。次に、10マイクロリットルの市販のカスパーゼ3/7試薬をタンパク質抽出物とブランクウェルにピペットで入れます。次に、プレートを15秒間軽く振って、2つの試薬を混合します。
室温で暗闇で30分間インキュベートします。最後に、発光プレートリーダーを使用してサンプルの発光を測定します。