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マクロファージは、アポトーシス(食作用によるプログラムされた細胞死)を受けている細胞を除去する特殊な免疫細胞です。
アポトーシス細胞の飲み込みを評価するには、血球(無脊椎動物のマクロファージ)に飲み込まれたアポトーシス小体を含む、固定ショウジョウバエ胚細胞を含むスライドガラスから始めます。
まず、非特異的部位をブロックするブロッキング試薬で細胞を処理します。クロクモート受容体 - 血球の食作用マーカー - に結合する一次抗体を追加します。余分な抗体を洗い流します。
一次抗体に結合するアルカリホスファターゼ標識二次抗体を追加します。次に、スライドに適切な発色基質溶液を加え、インキュベートします。インキュベーション中、アルカリホスファターゼは発色基質と反応して、血球中に紫色に染色された顆粒を生成します。
次に、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、TdT酵素、およびジゴキシゲニン結合ヌクレオチドを含む反応混合物を加えます。TdTは、アポトーシス小体の断片化されたDNAの露出した3'OH末端へのジゴキシゲニン結合ヌクレオチドの付着を触媒します。
次に、DNA損傷部位のヌクレオチドに結合するペルオキシダーゼレポーターに結合した抗ジゴキシゲニン抗体を追加します。ペルオキシダーゼ特異的発色基質溶液で細胞を処理し、インキュベートします。ペルオキシダーゼは基質の酸化を触媒し、着色された沈殿物を生成し、アポトーシス小体を茶色に染色します。
最後に、光学顕微鏡で細胞を視覚化します。紫色の顆粒と細胞からの茶色のシグナルの共存は、貪食されたアポトーシス小体を含む血球を示しています。
抗クロクモート抗体で細胞を免疫染色するには、まずスライドをメタノールに連続的に浸漬し、次に0.2%Triton X-100を添加したPBS、次にPBSのみを浸します。次に、PBS + 0.2%Triton X-100中の20マイクロリットルの5%全ブタ血清で、室温で20分間非特異的結合をブロックします。余分なブロッキング溶液を取り除き、摂氏4度で一晩20マイクロリットルの抗クロクモート抗血清で細胞に標識します。
翌朝、PBS + Triton X-100でスライドを洗浄し、10分間のインキュベーションを5回行います。最後の洗浄後、スライドをPBSで10分間すすぎます。次に、20マイクロリットルのアルカリホスファターゼ標識抗ラットIgGで細胞を室温で1時間標識します。
インキュベーションの最後に、示されているように、スライドをPBS + Triton X-100で5回洗浄し、続いて緩衝液に10分間浸します。次に、ホスファターゼ基質溶液で細胞を標識し、光学顕微鏡で細胞を観察します。
血球顆粒に強い紫色のシグナルが現れたら、余分な基質を取り除き、EDTAを添加したバッファーにスライドを5〜10分間浸します。インキュベーションの最後に、細胞を2回の5分間のPBS洗浄ですすぎ、平衡バッファーで10分間処理します。
溶液を除去した後、20マイクロリットルの末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ溶液を摂氏37度で1時間細胞に標識します。次に、スライドから溶液を取り出し、細胞を0.5ミリリットルの洗浄バッファーを17ミリリットルの水に10分間浸します。次に、細胞を3回の5分間のPBS洗浄ですすぎ、20マイクロリットルの抗ジゴキシゲニンペルオキシダーゼで室温で30分間標識します。
インキュベーションの最後に、示されているように、細胞をPBSで4回洗浄し、アポトーシス細胞が茶色になるまでスライドをペルオキシダーゼ基質に30秒刻み浸します。最適な染色が達成されたら、スライドを水に浸してペルオキシダーゼ反応を止めます。