JoVE 実験百科事典
生物学的技法
0 回視聴 • 4:57 分 • July 8th, 2025
アポトーシス(プログラムされた細胞死)を受けている細胞は、細胞表面にイートミーシグナルを示し、特殊な免疫細胞である食細胞による分解を促進します。アポトーシス細胞のクリアランスのこのプロセスは、エフェロサイトーシスと呼ばれます。
エフェロサイトーシスアッセイを実行するには、まず、二重染色されたアポトーシス細胞の懸濁液を採取します。これらの細胞の表面はビオチンで標識され、細胞質は細胞追跡色素で標識され、アポトーシス細胞由来物質にタグを付けます。
細胞懸濁液を、発泡球として機能する接着したマクロファージ細胞の培養物に加えます。遠心分離機で、マクロファージとアポトーシス細胞との接触を強制し、インキュベートします。
マクロファージのエフェロサイト受容体は、アポトーシス細胞膜上のホスファチジルセリン(eat-meシグナル)に結合し、その飲み込みを促進します。アポトーシス細胞の小さな断片は、エフェロソームと呼ばれる膜結合小胞内で取り込まれます。
これにより、エフェロサイトーシス画分(マクロファージ内のアポトーシス細胞の一部)と非エフェロサイトーシス画分(アポトーシス細胞の内在化されていない部分)が生じます。
蛍光標識ストレプトアビジンを添加し、非発泡細胞画分の表面にある露出したビオチン分子に結合し、アポトーシス細胞の非内在化部分と内在化
部分を区別します。蛍光顕微鏡下では、内在化されていないアポトーシス細胞画分はストレプトアビジン標識を示しますが、エフェロソームはストレプトアビジンを含まない個別のドットとして現れます。
エフェロサイトーシスを定量化するには、離散的なエフェロソームの数を決定し、エフェロサイトーシスおよび非エフェロサイトーシスアポトーシス細胞画分の強度を測定します。
ヒトマクロファージとアポトーシスJurkat細胞を調製した後、血球計算盤を使用してアポトーシス細胞をカウントします。次に、十分な量のアポトーシス細胞を1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。
Jurkat細胞を500回gで5分間遠心分離してペレット化します。次に、細胞を500マイクロリットルのPBSに再懸濁します。Jurkat細胞が遠心分離機にある間に、10マイクロリットルのDMSOを新しい微量遠心チューブに分注します。
次に、最小限のNHS-ビオチンをDMSOに溶解します。この後、500マイクロリットルのアポトーシス細胞とPBS懸濁液をDMSOおよびNHS-ビオチンを含むチューブに移します。次に、製造元の指示に従って適切な細胞追跡色素を希釈します。
細胞懸濁液を室温で暗所で20分間インキュベートします。次に、等量のRPMI 1640と10%FBSを加え、懸濁液を室温で暗所でさらに5分間インキュベートします。
この後、500 g で遠心分離して細胞を 5 分間ペレット化します。次に、上清
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