alamarBlue Assay:人工涙液製剤がヒト角膜上皮細胞の代謝活性に及ぼす細胞毒性効果をスクリーニングするための高感度蛍光測定法

涙液層 (目を覆う保護液) は、眼の角膜上皮細胞 (CEC) を潤滑し、健康で代謝活性な状態に維持するのに役立ちます。ドライアイ疾患のように涙液層が損なわれると、CEC からの涙液蒸発を引き起こし、感染や炎症性損傷に対する感受性を高める可能性があります。

人工涙液製剤は涙液層を安定させ、保水性を向上させ、細胞の脱水を防ぎます。

alamarBlueアッセイを使用してCECに対する試験人工涙液製剤の細胞毒性効果をスクリーニングするには、適切な培地でのヒト由来CECの接着培養から始めます。メディアを廃棄します。

細胞培養物を特定の濃度の人工涙液製剤でインキュベートします。涙液製剤は細胞の上にコーティングを形成します。構成成分の累積効果によっては、細胞は代謝活動の低下を経験する可能性があります。

次に、青色で蛍光が弱く、毒性のない水溶性染料であるレサズリンを含むアラマーブルー溶液を加えます。

レサズリンは細胞内に拡散し、呼吸代謝プロセスの電子供与体からの電子を受け入れるため、主にミトコンドリアレダクターゼによって代謝活性細胞で不可逆的に還元され、ピンク色の高蛍光レゾルフィンを形成し、細胞から溶液に自由に移動します。レゾルフィン含有溶液を新鮮なマルチウェルプレートに移します。

蛍光プレートリーダーを使用して、蛍光強度を測定します。蛍光強度値が低い場合は、細胞代謝活性が低いことを示し、CEC に対する涙液製剤の望ましくない影響を示唆しています。

ウェルから培地を取り出し、すぐに150マイクロリットルの試験製剤または培地対照溶液で細胞を処理します。次に、細胞を30分間インキュベートします。

細胞から試験溶液を取り出し、0.5ミリリットルの10%代謝色素溶液を加えます。細胞をさらに4時間インキュベートします。

インキュベーション後、各ウェルから100マイクロリットルの色素溶液を取り出し、96ウェルプレートに移します。プレートリーダーを使用して各ウェルの蛍光を測定し、励起を540ナノメートル、発光を590ナノメートルに設定します。