腸内酸性化モニタリングアッセイ:ブロモフェノールブルー色素を使用してショウジョウバエの腸管腔の酸性化を研究する技術

昆虫の中腸には、腸の酸性化に関与する銅細胞領域(CCR)が含まれています。この領域には、隣接する間質細胞によって形成される狭いチャネルを通過する酸を生成する特殊な分泌細胞(銅細胞)が含まれています。酸は消化を助けるために腸管腔に放出されます。

ショ

ウジョウバエの腸酸性化を監視するには、十分な期間飢えた成虫のハエを取ります。ブロモフェノールブルー(BPB)(pH感知指示色素)を添加したハエの餌を1滴入ったペトリプレートにハエを置きます。飢えたハエを一定期間採餌させます。

食物摂取後、銅細胞によって生成された酸は腸管腔に到達し、BPBを含む食物と混合します。酸性のpHでは、BPB分子はプロトン化され、色が青から黄色に変わり、酸性化を示します。

実験時間が終了したら、ペトリプレートを氷の上に置きます。低温はハエの神経筋活動を停止し、それらを麻酔します。個々のハエを実体顕微鏡下に置き、無傷の消化管を外科的に分離します。

CCRの色を調べて、腸の酸性化の状態を判断します。黄色は酸性化を示し、青色は酸性化がないことを示します。

すべてのハエの消化管を検査し、腸の酸性化を示す個体の割合を計算します。

pH感知ブロモフェノールブルーまたはBPB色素でフライフードを調製することから、腸酸性化モニタリングアッセイの手配を開始します。そのためには、フライフードを電子レンジで溶かし、ぬるま湯になるまで冷まします。1ミリリットルの4%BPBを1ミリリットルのぬるま湯に加え、よく混ぜます。ピペットを使用して、BPBを含むフライフードをペトリ皿の中央にある約200マイクロリットルの1つのドットに加えます。

次に、生後0〜2日の非処女、メスのショウジョウバエ、ショウジョウバエ、メラノガスターハエを集め、ハエが標準的なコーンミールフードで回復できるようにします。実験の前に、約24ミリリットルの脱イオン水に浸した実験室用ワイプティッシュを入れたバイアルに入れて、ハエを室温で2時間飢えさせます。

飢えたハエを、2%BPBを添加した作りたてのハエフードの1つのドットを含むペトリ皿に移し、ハエが光にさらされた状態で室温で4時間採餌できるようにします。

4時間後、ハエを集めます。次に、実体顕微鏡下で鉗子を使用して1x PBSで麻酔されたハエの腸を外科的に分離します。腸内に強力なBPB染色を示すハエの数を数え、式を使用してパーセンテージを計算します。