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植物組織中の可溶性タンパク質含有量を定量するには、チューブ内で、適切な量の粉砕した凍結乾燥植物組織から始めます。
アルカリである水酸化ナトリウムをチューブに加え、超音波処理します。機械的な力を伴うアルカリ性環境は細胞を破壊し、高分子(可溶性タンパク質や炭水化物)を含む細胞内内容物を放出します。高温でインキュベートします。
熱の存在下では、アルカリはタンパク質の加水分解を引き起こし、より小さなペプチドを形成し、タンパク質の溶解度を高めます。さらに、炭水化物は分解されます。
混合物を遠心分離します。可溶化したタンパク質含有上清を回収します。塩酸を加えてpHを中和します。
サンプルをトリクロロ酢酸、TCAで処理します。TCA はタンパク質を取り巻く水和殻を破壊し、タンパク質の凝集と沈殿を引き起こします。
TCA含有上清を遠心分離して除去します。タンパク質ペレットを氷冷のアセトンで洗浄し、可溶性タンパク質の推定を妨げる可能性のある残留TCAを除去します。
アセトンを自然乾燥させます。タンパク質ペレットを水酸化ナトリウムに再懸濁します。脱イオン水で希釈します。マルチウェルプレートのウェルに移します。
クマシーブリリアントブルーG-250染料の酸性溶液を加えます。酸性条件下では、色素は可溶化タンパク質の塩基性アミノ酸残基に結合し、青色のタンパク質-色素複合体が得られます。
分光光度計を使用して、植物組織中の可溶性タンパク質含有量に比例したタンパク質-色素複合体の吸光度を測定します。
まず、各組織の複製サンプルを標識された1.5ミリリットルの微量遠心チューブに計量します。次に、各サンプルの正確な質量を記録します。マイクロピペッターを使用して、500マイクロリットルの0.1モル水酸化ナトリウムを各チューブに加えます。蓋をしっかりと閉め、チューブを30分間超音波処理します。
次に、チューブを予熱した温水浴に15分間入れます。この後、チューブを15,000 gで10分間遠心分離します。サンプルごとに新しいピペットチップを使用して、上清を新しい標識マイクロ遠心チューブにピペットで入れます。
300マイクロリットルの0.1モル水酸化ナトリウムをペレットに加え、遠心分離を10分間繰り返します。この後、上清を取り出し、最初の遠心分離で上清を含むチューブに移します。
上清のpHを中和するには、11マイクロリットルの5.8モル塩酸を加えます。リトマス試験紙を使用して、pHが約7であることを確認します。
次に、90マイクロリットルの100%トリクロロ酢酸を各チューブに加えます。次に、チューブを氷上で30分間インキュベートします。サンプルを13,000 gで摂氏4度で10分間遠心分離します。慎重に、真空ラインとガラス製マイクロピペットチップを使用してトリクロロ酢酸を除去します。
吸引先端でペレットを乱さないように十分注意してください。
次に、摂氏マイナス20度に冷却した100マイクロリットルのアセトンでペレットを洗浄します。次に、アセトンをヒュームフード内で蒸発させます。タンパク質ペレットを1ミリリットルの水酸化ナトリウムで溶解します。追加の加熱、ボルテックス、および超音波処理が必要になる場合があります。
各IgG標準溶液160マイクロリットルを、A1の位置から始めて、3回ずつ96ウェルプレートに加えます。次に、新しい1.5ミリリットルのチューブに、各サンプル溶液50マイクロリットルを950マイクロリットルの蒸留水に加えます。次に、希釈した各サンプルを60マイクロリットルをH1位置から始めて3回に分けてウェルプレートに加えます。100マイクロリットルの蒸留水を、すべてのブランクおよび未知のサンプルウェルに加えます。
マルチチャンネルピペットを使用して、40マイクロリットルのクマシーブリリアントブルーG-250タンパク質色素をプレートの各ウェルに加えます。針を使用して、井戸に存在する気泡をはじきます。この後、プレートを室温で5分間インキュベートします。次に、マイクロプレート分光光度計を使用して、各ウェルの吸光度値を595ナノメートルで記録します。