細胞内寄生虫の増殖を定量するためのルシフェラーゼベースの増殖アッセイ

トキソプラズマ原虫 - 単細胞原虫 - は絶対的な嫌気性寄生虫であり、宿主細胞内でのみ繁殖します。

ルシフェラーゼベースのアッセイを使用して寄生虫の細胞内増殖を定量化するには、ルシフェラーゼ(その基質との反応で発光を生成する酵素)を発現する寄生虫細胞の懸濁液を採取します。懸濁液をヒト包皮線維芽細胞の培養物に加え、適切な時間インキュベートします。

寄生虫は宿主細胞受容体に結合し、エンドサイトーシスプロセスを介して内在化され、寄生液胞を形成します。この構造は、寄生虫が繁殖するためのニッチを提供します。

感染後、培地を吸引し、内在化されていない寄生虫を除去します。界面活性剤とルシフェリン - ルシフェラーゼの基質 - を含む溶解バッファーを加える。緩衝液中の界面活性剤は細胞膜に細孔を作り、細胞を完全に溶解し、ルシフェラーゼを放出します。

放出された酵素はルシフェリン分子を酸化し、光を発します。ルシフェラーゼ活性を決定するために発光強度を測定します。感染した宿主細胞を含む複製ウェルを使用して、感染後所定の間隔でルシフェラーゼ活性を測定します。

正規化された発光強度と時間間隔をプロットして、時間の経過に伴う寄生虫の増殖の倍数変化を取得します。強度の一時的な上昇は、寄生虫の増殖が成功したことを示します。

値を対数スケールでプロットして、寄生虫の倍増時間を表す曲線の傾きを計算します。

ルシフェラーゼベースのトキソプラズマ増殖アッセイを実行するには、まず、ヒト包皮線維芽細胞の播種済み96ウェルマイクロプレート培養物から培地を慎重に吸引し、150マイクロリットルの寄生虫を含まない懸濁液を3列5列形式でウェルに接種します。

細胞培養インキュベーターで4時間インキュベートした後、各ウェルから培地を慎重に吸引して、侵入していない寄生虫を除去し、最初の列を除く各列のウェルを室温のフェノールレッドフリー培地で満たします。次に、100マイクロリットルのPBS中の12.5マイクロモルルシフェラーゼ基質溶液を最上段の各ウェルに加え、マイクロプレートを室温で10分間インキュベートして全細胞溶解を可能にします。

インキュベーションの最後に、マイクロプレートリーダーでルシフェラーゼ活性を測定します。各測定値は、感染後 4 時間で侵入した寄生虫の初期数を表します。次の4日間は、培地を変更せずに24時間ごとに分析を繰り返します。

寄生虫増殖の正規化された倍数変化を計算するために、各測定値を感染後 4 時間の最初の測定値で割ることができます。次に、寄生虫増殖の正規化された倍数変化のlog2を各時点に対してプロットし、線形回帰関数を適用して、倍加時間を表す傾きを得ることができます。