寄生虫に対する抗寄生虫薬品の有効性を研究するためのルシフェラーゼアッセイ

トキソプラズマ原虫(原生動物の寄生虫)は、有核動物宿主細胞内でのみ繁殖します。エンドサイトーシスプロセスを通じて宿主細胞に侵入し、寄生液胞を形成します。液胞の内部では、寄生虫は宿主の細胞質ゾルタンパク質を摂取し、成長のための栄養素を獲得します。

宿主細胞内の寄生虫に対する抗寄生虫化学物質の有効性をスクリーニングするには、複数のウェルでヒト包皮線維芽細胞の接着培養物を含むアッセイプレートを取ります。

ル

シフェラーゼ(発光産生酵素)を発現するトキソプラズマ原虫を各ウェルに同量分注します。インキュベートし、寄生虫が宿主細胞に侵入し、寄生液胞内で増殖できるようにします。

インキュベーション後、培地を吸引し、摂取されていない寄生虫を除去します。ウェルに異なる濃度のシステインプロテアーゼ標的抗寄生虫化合物を補充し、インキュベートします。

薬物分子は宿主細胞に入り、寄生虫に到達します。薬物が侵入すると、寄生虫のシステインプロテアーゼ酵素を阻害し、宿主に結合した寄生虫の栄養素獲得を妨害し、その増殖を阻止します。

薬物含有培地を吸引します。ルシフェラーゼ酵素に特異的な基質を含むアッセイバッファーを追加します。緩衝成分が細胞を溶解し、寄生虫のルシフェラーゼ酵素が基質を酸化させ、明るい発光を生成します。

すべての化学的阻害剤濃度の発光を測定します。薬物濃度の増加に伴う発光強度の低下は、化学阻害剤の駆虫効果を示しています。

トキソプラズマの増殖に対する目的の化合物の阻害の有効性を評価するには、ヒト包皮線維芽細胞を96ウェルマイクロプレートで少なくとも7日間培養してから、実証されているように、細胞の各ウェルに150マイクロリットルの寄生虫を接種し、摂氏37度および5%の二酸化炭素で4時間

。

インキュベーション中、目的の化合物を12壁のリザーバーで8つの異なる濃度で連続希釈して調製します。

12ウェルリザーバーで化合物を1:3の希釈で希釈し、各混合物を1ミリリットルのピペットで数回上下にピペッティングします。

感染後4時間で、カラム2から9までの各ウェルの培地を、化合物の各希釈液を添加した150マイクロリットルの培地に交換し、最初のカラムを通常の培地で満たして未処理のコントロールとして使用します。次に、細胞培養物を細胞培養インキュベーターに96時間戻し、各ウェルのルシフェラーゼ活性を測定して、化合物の各濃度での培養物中の増殖阻害の割合を決定します。

正規化されたルシフェラーゼ活性をパーセンテージで計算するには、各化合物濃度の平均ルシフェラーゼ活性を、未処理の寄生虫に由来する平均ルシフェラーゼ活性で割ります。

次に、適切なグラフ作成ソフトウェアプログラムを使用して、個々の化合物に対する正規化されたルシフェラーゼ活性をプロットし、各化合物の半分最大阻害濃度を計算します。