誤って局在化したTAタンパク質の除去を研究するためのMsp1抽出アッセイ

ミトコンドリア外膜のATPアーゼであるMsp1は、六量体の中央細孔を介して膜から局在不良の尾部固定(TA)タンパク質を除去し、それらの分解を促進します。

転座のメカニズムを理解するには、TAタンパク質とMsp1をリポソームに共構成し、脂質二重層への統合を可能にします。

再

構成したリポソームをシャペロン(サイトゾル品質管理タンパク質)を含む適切なバッファーに添加して、反応混合物を調製します。シャペロンには、グルタチオン-S-トランスフェラーゼまたはGST酵素がタグ

付けされています。

アデノシン三リン酸(ATP)を反応に加えます。Msp1はATP分子に結合し、それらを加水分解します。Msp1は、加水分解によって生成されたエネルギーを使用して、膜結合したTAタンパク質をその中央細孔を通して転座させます。反応混合物中のシャペロンは、抽出されたTAタンパク質の膜貫通ドメインに結合します。

次に、反応混合物をアフィニティー精製カラムにロードします。カラムには、還元型グルタチオンまたはGSHと結合した樹脂が含まれています。シャペロン上のGSTタンパク質は、共役GSH(その基質)に結合し、シャペロン-TAタンパク質複合体を樹脂に結合させます。

カラムを回転させて、リポソームに組み込まれたままのTAタンパク質を除去します。次に、過剰なGSHを含む溶出バッファーを追加します。遊離GSH分子は、GSTと共役GSHの間の結合を競合的に置換します。

遊離したシャペロン-TAタンパク質複合体をバッファーで溶出します。溶出液を分析して、リポソームからのTAタンパク質の除去を示すTAタンパク質の存在を確認します。

SDS-PAGE分析用のチューブを準備します。45マイクロリットルの二重蒸留水を入力チューブに、40マイクロリットルの水をフロースルーチューブに、16.6マイクロリットルの4X SDS-PAGEローディングバッファーを各チューブに加えます。

抽出アッセイでは、抽出反応を準備し、抽出バッファーで最終容量を200マイクロリットルに上げます。次に、抽出アッセイを摂氏30度のヒートブロックで2分間予熱します。

アッセイを開始するには、ATPを最終濃度2ミリモルまで添加します。チューブをピコフゲで5秒間回転させ、摂氏30度で30分間インキュベートします。

インキュベーション中に、反応の5マイクロリットルのサンプルを採取し、インプットチューブに加えます。また、示されているように、抽出アッセイのサンプルごとに1つのグルタチオンスピンカラムを平衡化します。

30分間のインキュベーションが完了したら、200マイクロリットルの抽出バッファーをチューブに加え、総容量を400マイクロリットルにします。次に、この反応を平衡化したグルタチオン樹脂に加え、摂氏4度で30分間回転させます。

回転後、カラムを回転