寄生虫の薬物誘発性細胞毒性を評価するためのβ-ガラクトシダーゼアッセイ

偏性細胞内寄生虫であるトリパノソーマ・クルジは、トリポマスティゴート(鞭毛のある非増殖性の発達段階)として哺乳類の宿主細胞に侵入し、非鞭毛アマスチゴートに分化し、二分裂によって細胞質内で増殖します。

増殖後、アマスチゴートはトリポマスチゴートに分化し、宿主細胞が循環に入るのを妨害し、全身感染を引き起こします。

トリパノソーマ・クルジに対する試験用抗寄生虫薬のin vitro細胞毒性の可能性を評価するには、酵素β-ガラクトシダーゼを安定的に発現するトランスジェニック・トリパノソーマ・クルジ寄生虫の培養から始めます。

寄生虫を適切な媒体に懸濁します。マルチウェルプレートに移します。適切な濃度の試験用駆寄生虫薬を追加します。インキュベート。

薬物は寄生虫の膜を通って受動的に拡散し、有毒な中間体に代謝されます。これらの代謝産物は核に入り、DNA 損傷を引き起こし、β-ガラクトシダーゼを含むタンパク質合成を阻害し、寄生虫の生存率に悪影響を及

ぼします。

吸光度測定中の色の干渉を防ぐために、薬物含有媒体をバッファーに交換してください。β-ガラクトシダーゼ、クロロフェノールレッドガラクトピラノシド、CPRG(無毒のガラクトシド類似体)の基質に、非イオン性の中性洗剤を加えます。インキュベート。

洗

剤は寄生虫を溶解し、溶液中にβ-ガラクトシダーゼを放出します。その後、β-ガラクトシダーゼがCPRGを加水分解し、赤色の沈殿物であるクロロフェノールレッドを生成します。

マイクロプレートリーダーを使用して、クロロフェノールレッドの吸光度を測定します。吸光度が低い場合は、β-ガラクトシダーゼ活性が低いことを示し、特定の濃度での試験用駆虫薬の高い細胞毒性の可能性を示唆しています。

テキスト原稿に記載されているように、ベンズニダゾール溶液をエピマスチゴート、アマスチゴートを含むベロ細胞、またはトリポマスチゴートに加えます。次に、エピマスチゴートを摂氏28度で72時間インキュベートし、トリポマスチゴートまたは感染したベロ細胞をアマスチゴートで摂氏37度、二酸化炭素5%で24時間インキュベートします。

比色アッセイでは、100マイクロリットルのPBSまたは対応する培地を追加してブランクウェルをセットアップします。次に、40マイクロリットルのCPRG基質溶液と10マイクロリットルの界面活性剤溶液を各ウェルに加え、各ウェルの最終容量で200マイクロモルのCPRGと0.1%の界面活性剤の最終濃度を得る。

摂

氏37度で2時間インキュベートした後、マイクロプレート分光光度計を使用して595ナノメートルでの吸光度を測定します。