試験薬物曝露時の脳切片からのモノアミン放出を測定するためのプレートベースアッセイ

モノアミン神経伝達物質、内因性化学メッセンジャーは、ニューロン間の接触点であるシナプスを介して信号を中継します。厳密に調節されたモノアミン神経伝達物質システムは、正常なニューロン機能に不可欠です。

モノアミン放出に対する試験薬の効果をex vivoでスクリーニングするには、組織の生存率を維持しながら、冷却された酸素化緩衝液中に関心領域を含むラット脳組織スライスを取得します。

組織スライスをマルチウェルプレートのウェルに移し、多孔質フィルターインサートを気体混合物供給に接続し、モノアミンオキシダーゼ阻害剤を添加した酸素化人工脳脊髄液(aCSF)を含みます。インキュベート。

阻害剤は細胞内に拡散し、モノアミンオキシダーゼ酵素を不活性化し、モノアミンの分解を防ぎ、貯蔵および放出に利用できる濃度を高めます。

組織含有インサートを、酸素化されたaCSFと試験薬を含むウェルに移します。インキュベート。この薬剤はモノアミン神経伝達物質系を刺激し、神経細胞外腔のモノアミン濃度を上昇させ、脳組織から溶液へのモノアミンの放出につながる可能性があります。

放出されたモノアミンは、多孔質インサートを通ってウェルに入り、組織から分離します。

インキュベーション後、組織スライスを含むインサートを除去します。高速液体クロマトグラフィー(HPLC)に対応した溶媒を含むチューブにモノアミン溶液を回収します。チューブの内容物を組み立て済みのフィルターユニットに移します。遠心分離機で、主要な汚染物質を除去します。

得られた濾液をHPLCカラムにロードし、クロマトグラフィーを実行してモノアミン濃度を測定し、モノアミン放出に対する試験薬の効果を示します。

モノアミン放出を誘導するには、組織サンプルを、一定で穏やかなバブリングでウェルあたり0.5〜1ミリリットルの流出バッファーを含むカスタムメイドの48ウェル流出チャンバーの各ウェルに移し、サンプルを摂氏37度で30〜50分間回復させます。

平衡期間の終わりに、脳組織の入った組織ホルダーを、薬剤の有無にかかわらず500マイクロリットルの酸素化流出バッファーを含むウェルに移動し、ウェルの端にあるホルダーを軽くたたいて、ウェル間のバッファーの移動を最小限に抑えないようにし、摂氏37度で20分間インキュベートします。

インキュベーションの最後に、ホルダーを500マイクロリットルの流出バッファーを含む新しいウェルセットに移動し、目的の薬物の有無にかかわらず、プレートを細胞培養インキュベーターに戻します。

2回目のインキュベーション中に、最初のインキュベーションのウェルから、氷上の50マイクロリットルの1 N過塩素酸またはリン酸を含むマイクロ遠心チューブに溶液を移し、チューブに#1をラベル付けします。

2回目のインキュベーションの終わりに、プレートを氷上の空のウェルに組織ホルダーに移動し、2回目のインキュベーションから上清を氷上の50マイクロリットルの1N過塩素酸またはリン酸を含む新しい微量遠心チューブに移します。これらのチューブにラベルを付けます #2。

すべての上清が移されたら、1ミリリットルの氷冷解剖バッファーを組織の各ウェルに加え、小さなピンセットを使用して各組織サンプルを新しい微量遠心チューブに移します。サンプルチューブからバッファーを取り出し、組織を摂氏-80度で保存します。次に、収集したインキュベーション溶液を遠心分離のために微量遠心フィルターチューブに移し、HPLC分析まで濾液を氷上に置きます。