大動脈弁間質細胞のカルシウム濃度を測定するための石灰化アッセイ

大動脈弁尖には、細胞外マトリックス層全体に分布する弁間質細胞 (VIC) の不均一な集団が含まれています。刺激を受けると、VICは骨芽細胞(骨基質形成細胞)に変化します。

成熟した骨芽細胞は、コラーゲンと骨基質タンパク質を分泌します。これらのタンパク質は、骨芽細胞がマトリックスに付着するのを助けます。最後に、細胞内カルシウムイオンがマトリックス環境に入り、リン酸塩とともに石灰化結節として沈着し、大動脈弁の石灰化を引き起こします。

石灰化した大動脈弁のカルシウム濃度を評価するには、6ウェルプレートでのVICの培養から始めます。培地を廃棄し、骨形成培地をウェルに加え、インキュベートします。

インキュベーション中、骨形成培地中のインスリンはVICを刺激して骨形成表現型に分化します。これらの骨芽細胞は、骨形成培地中に骨基質タンパク質とアスコルビン酸を分泌し、コラーゲンが豊富な細胞外マトリックスを形成するように誘導します。

最後に、骨芽細胞の細胞内カルシウムと培地のリン酸塩は、培地中に石灰化した結晶を形成します。

培地を取り除き、塩酸溶液を加えます。インキュベートしてカルシウムイオンを溶液に可溶化します。カルシウムを含む酸性培地をマルチウェルプレートのウェルに分注します。

カルシウム感受性色素を加え、インキュベートします。色素分子は酸性媒体中のカルシウムイオンに結合し、紫色の色素-カルシウム複合体を形成します。

サンプル中のカルシウム濃度に比例する複合体の吸光度を測定します。

アッセイを開始する前に、バイオセーフティフードを70%エタノールで洗浄し、DMEM培地を摂氏37度に温めます。次に、条件ごとに100,000個の細胞を完全なDMEMの6ウェルプレートに播種し、摂氏37度で培養します。

24時間後、上清培地を石灰化培地に交換し、細胞を摂氏37度で7日間インキュベートし、3日目に培地を交換します。

7日後、Arsenazo III試薬を使用して96ウェルプレート内のカルシウム濃度を測定し、650ナノメートルで吸光度を記録します。