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ゼブラフィッシュでは、周囲の微粒子状物質(PM)(大気汚染物質)が酸化ストレスによる心臓機能不全を引き起こします。
ゼブラフィッシュに対するPMの影響を研究するには、まずゼブラフィッシュの胚をPM由来の抽出可能な有機物(EOM)にさらし、活性酸素種(ROS)の生成を引き起こします。
ROSは、DNA塩基グアニンを8-ヒドロキシ-2'-デオキシグアノシンまたは8-OHdGに酸化し、ヒストンH2AXのリン酸化を引き起こして、DNA二本鎖切断のマーカーであるγH2AXを形成します。
露光後、ゼブラフィッシュの心臓を解剖し、スライドガラスの上に置きます。タンパク質を架橋し、細胞構造を安定させる固定液で心臓を治療します。
次に、非特異的結合部位を防ぐためにブロッキング試薬を追加します。心臓細胞内のγH2AXおよび8-OHdGを標的とする一次抗体を追加します。
次に、それぞれの一次抗体のFc領域に特異的に結合する2つの異なる色の蛍光標識二次抗体を追加します。最後に、DNA内のATに富む配列の小さな溝に結合して蛍光複合体を形成するDAPI(DNA特異的染色剤)で検体を染色します。
スライドを蛍光顕微鏡下に置き、EOM処理されたゼブラフィッシュ胚の心臓における8-OHdGおよびγH2AX発現からのシグナルを観察します。
心臓細胞からの非常に高い蛍光強度は、EOM誘発性酸化的DNA損傷と二本鎖切断を示します。
疎水性バリアペンを使用して、きれいなスライドガラスに円を描きます。50マイクロリットルの4%パラホルムアルデヒドを1.25マイクロリットルのPBSに加えて、固定液を作ります。次に、解剖した3つの心臓を1つの疎水性バリアサークルに入れ、室温で20分間インキュベートします。
顕微鏡下で溶液をデカントし、サンプルを室温で少なくとも5分間乾燥させます。スライドをPBSTで3回、1回の洗浄に5分間洗浄します。50マイクロリットルのBSAを1,000マイクロリットルのPBSTに加えて5%BSA溶液を得、スライドを湿ったチャンバーで1時間インキュベートして、非特異的抗体結合をブロックします。
溶液をデカントし、サンプルをPBSで3回洗浄し、洗浄ごとに5分間洗浄します。8-ヒドロキシ-デオキシグアノシンに対するマウスモノクローナル抗体2マイクロリットル、およびガンマH2AXに対するウサギポリクローナル抗体2マイクロリットルを296マイクロリットルのPBSTで希釈して、機能する一次抗体カクテル溶液を得る。
心臓サンプルを50マイクロリットルの一次抗体カクテル溶液とともに、加湿チャンバー内で室温で少なくとも1時間、または摂氏4度で一晩インキュベートします。
溶液をデカントし、サンプルをPBSTで3回洗浄し、洗浄ごとに5分間洗浄します。1マイクロリットルのFITC標識ヤギ抗マウス二次抗体と1マイクロリットルのcy3ヤギ抗ウサギ二次抗体を500マイクロリットルのPBSTで希釈して、有効な二次抗体カクテル溶液を取得します。
サンプルを二次抗体とともに室温で暗所で1時間インキュベートします。
溶液をデカントし、サンプルをPBSで3回洗浄し、洗浄ごとに5分間洗浄します。核染色のためにサンプルに20マイクロリットルのDAPIを加え、室温で30分間インキュベートします。スライドにカバーガラスを貼り、乾燥や動きを防ぐためにマニキュアで密封します。
サンプルを蛍光顕微鏡で画像化し、ImageJソフトウェアを使用して心臓領域の蛍光シグナルを定量化します。DMSOコントロールサンプルの平均を使用して相対的な変化を計算し、データの統計的有意性を決定します。