ex vivoてんかんモデルにおける細胞死を評価するためのニューロン死アッセイ

てんかん(脳内の自発的および再発性発作)は、神経細胞死につながります。

ex vivoてんかんモデルでニューロン死を研究するには、ラットの子犬の脳から調製された鼻皮質-海馬の器官型スライスを適切な培地で採取することから始めます。

器官型スライスは、鼻皮質と海馬で構成されています。徐々に血清が欠乏すると、これらの領域はてんかんイベントの進行を示し、発作誘発性ニューロン死につながります。

必要な量のヨウ化プロピジウム(PI(蛍光色素)を培養物に加え、インキュベートします。損傷した細胞膜を通って、PIは死んだニューロンに入り、DNAに結合します。無傷の膜を持つ生きたニューロンは、PIを取り込むことができません。

免疫染色のために、器官型スライスを顕微鏡スライドに置きます。透過処理遮断液を加えてインキュベートします。

溶液中の界面活性剤分子は膜脂質を可溶化し、無傷の細胞の膜に細孔を作り、その後の免疫染色ステップのために透過性を高めます。ブロッキング溶液中のタンパク質は、細胞の非特異的部位に受動的に結合し、バックグラウンド染色を減少させます。

ニューロン内部に浸透し、核マトリックスに分布するニューロン特異的核抗原(NeuN)に結合する一次抗体溶液を追加します。一次抗体に結合する蛍光標識二次抗体を追加します。

スライドに封入剤を置き、試験片を安定させ、カバーガラスで密封します。共焦点顕微鏡下では、二重染色(PI陽性のNeuN染色ニューロン)を示す細胞は、ニューロンの死を示しています。

ヨウ化プロピジウム取り込みアッセイを実行するには、バイオセーフティキャビネットで作業します。

インサートをウェルから持ち上げ、ヨウ化プロピジウムを中に入れて、ウェルあたり2マイクロモルの最終濃度にします。プレートをゆっくりとかき混ぜてから、インサートをウェルに戻し、スライスの下に気泡がないように注意します。すべてのスライスが処理されたら、プレートを細胞培養インキュベーターに戻します。

スライスの免疫染色のために、ヨウ化プロピジウムのインキュベーションの最後に、各ウェルの底から培地を吸引し、各インサートの上部と下部に1ミリリットルの4%パラホルムアルデヒドを加えます。

室温で1時間後、スライスを10分間2回洗浄し、洗浄ごとに1ミリリットルのPBSを洗浄し、疎水性ペンを使用して顕微鏡スライドに2つの長方形を描きます。

鋭利な刃を使用してインサートからスライスを切り取り、各長方形に 1 つのスライスを置きます。透過処理/ブロッキング溶液を各スライスに加え、室温で3時間インキュベートします。インキュベーションの最後に、目的の一次抗体を各スライスに加え、摂氏4度で一晩インキュベートします。

翌朝、スライスをPBS-Tweenで3回、1回の洗浄ごとに10分間洗浄し、スライスを適切な二次抗体とともに室温