0 閲覧数 • 5:00 分 • July 8th, 2025
傷に反応して、分泌細胞はパラクリンシグナル伝達分子を産生し、筋芽細胞(未分化筋細胞)を活性化します。活性化された筋芽細胞は創傷部位に向かって移動し、そこで増殖して創傷を治癒させます。
invitroで筋芽細胞の遊走能力を評価するには、マウス筋芽細胞のコンフルエント単層を含むマルチウェルプレートを取ります。ピペットチップを使用して、単層を引っ掻き、ウェル内に線状の無細胞パッチを作成し、創傷部位をシミュレートします。
創傷パッチを乱さずに、成長培地をウェルに注意深く補充します。
神経堤細胞、またはNCC(分泌細胞)の接着培養物を含む膜インサートを適切な培地に取ります。インサートをウェルの内側に置き、基部のNCCが創傷パッチの近くになるようにします。共培養を所望の期間インキュベートします。
インキュベーション中、NCCは筋芽細胞上の特定の受容体に結合するシグナル伝達分子を放出し、シグナル伝達カスケードを開始します。このシグナル伝達は筋芽細胞におけるアクチンの再編成を促進し、その結果、これらの細胞は端にラメリポディアや糸状偽足などの細胞質突起を発達させます。これらの突起は、筋芽細胞が損傷した領域に向かって移動し、徐々に再増殖し、創傷治癒につながります。
プレートを顕微鏡下に置き、創傷治癒を観察し、その程度は共培養における筋芽細胞の遊走能力と相関します。
細胞が70%から80%のコンフルエンスに達したら、C2C12チャンバーウェルから上清培地を取り出し、PBSで細胞を一度洗浄します。
PBSを除去した後、滅菌済みのP10ピペットチップを一方向にしっかりと通して、細胞単層の全長または幅にまたがります。細胞に傷がついたら、1ミリリットルのPBSをすばやく加えます。
次に、コンピューターと顕微鏡の電源を入れます。チャンバースライドをステージに置き、対物レンズダイヤルを5倍に回転させます。イメージング ソフトウェアを開き、「カメラ」タブをクリックし、「ライブ」ボタンをクリックして、「AxioCam IC」タブでセルを視覚化します。
光がカメラとコンピューター画面に通過できるように、ライトフィルターが完全に引き出されていることを確認してください。チャンバースライドを手動で移動または回転させて、「AxioCam IC」タブのライブ画像の中央に創傷領域を配置します。画像を撮影するには、「スナップ」をクリックして、画像を含む「AxioCam IC」タブの横にある「新規」タブを開きます。
この静止画を保存するには、「ファイル」をクリックし、「名前を付けて保存」を選択し、左側のバーの「デスクトップ」を選択してファイルをデスクトップに保存します。ファイル名ボックスに「ファイル名」を入力し、図を「.czi」ファイル形式で保存します。
画像を「.tiff」として保存するには、「ファイル」をクリックし、「名前を付けて保存」を選択し、ファイル名ボックスに「ファイル名」を入力し、「名前を付けて保存」ボタンをクリックして、ドロップダウンメニューから「*.tiff」を選択します。
チャンバースライドの位置を手動で変更して、同じウェル内の創傷の他のポイントでさらに2〜3枚の画像を撮影します。イメージング後、各ウェルからPBSを取り出し、1ミリリットルのC2C12培地を加えます。
O9-1細胞を含むインサートをチャンバーウェルの各ウェルに手動で配置することにより、ウェルインサート共培養システムを組み立てます。インサートの底が下にあるC2C12セルのすぐ上に収まるように、インサートをウェルにそっと押し下げます。ウェルインサートコンストラクトをインキュベーターに戻し、細胞を合計9〜12時間移動させます。
最適な移動時間を決定するには、創傷の作成後6時間で細胞をチェックし、その後2〜3時間ごとに細胞をチェックします。対照条件の細胞が傷を完全に覆ったら実験を終了します。