細胞内のDNA損傷検出のためのCometアッセイ

有害物質にさらされると、細胞DNAに一本鎖および二本鎖の切断が誘発され、DNA損傷につながります。

DNA損傷を検出するには、液化した低融点アガロース中の化学処理細胞の単一細胞懸濁液から始めます。懸濁液をスライドガラスにロードし、アガロースを固化させ、多孔質ゲルマトリックス内の細胞を固定化できるようにします。

細胞を溶解バッファーで処理します。緩衝液中の界面活性剤は細胞膜と核膜を可溶化し、塩はDNAからヒストンを除去し、核マトリックスに結合したDNAを含む核様体を形成します。

スライドをアルカリ電気泳動バッファーでインキュベートします。これにより、DNAがほどかれ、一本鎖断片が生成されます。スライドを電気泳動装置に入れ、電源に接続します。これにより、負に帯電したDNAを正の陽極に向かって移動させることができます。

損傷していないDNAは、核様体内に制限されたままです。対照的に、小さくて損傷したDNA断片は、陽極に向かって移動し始めます。この差動運動は彗星のような構造を形成し、損傷していないDNAが頭を形成し、損傷したDNAが彗星の尾を形成します。

スライドを中和バッファーでインキュベートして、一本鎖DNAフラグメントが再生成できるようにします。次に、DNAを染色する蛍光色素でスライドを処理します。蛍光顕微鏡でスライドを可視化します。

尾の強度と長さは、細胞DNA損傷の程度と相関しています。

まず、PBSで0.6%の低融点アガロースを調製し、摂氏37度のウォーターバスに入れます。油性マーカーまたは鉛筆を使用して、事前にコーティングされたスライドのつや消し端に名前、日付、および治療情報でラベルを付けます。

平らなベンチにチルディングプレートを置き、2つの冷凍冷却パックを金属表面の下のスライド式引き出しに挿入します。次に、スライドをチルリングプレートの上に置き、1〜2分間予冷します。サンプルチューブから上清を遠心分離して除去し、すぐに氷上に戻します。細胞ペレットを200マイクロリットルの0.6%低融点アガロースで再懸濁し、ピペッティングで混合します。

次に、80マイクロリットルのアガロース含有細胞を冷やしたスライドに加え、ゲル上にカバーガラスをすばやく置きます。ゲルをチルリングプレートに1〜2分間固めます。その間に、500ミリリットルの溶解バッファーの作業溶液を調製し、それを溶解皿に注ぎます。

ゲルが固まったら、親指と人差し指でスライドをそっと持ち、カバーガラスをゲルからスライドさせて、カバーガラスをすばやく取り除きます。次に、スライドをスライドキャリアの中に置き、スライド上のすべての黒い点マークを同じ方向に向けます。スライドキャリアを溶解皿の中に置きます。溶解皿の蓋を閉め、インキュベーションにかけます。

ゲルを乱さずに、スライドキャリアを溶解皿から慎重に取り外します。氷冷の二重蒸留水をあらかじめ入れた洗濯皿にスライドキャリアをそっと置きます。スライドが完全に水没していることを確認し、セットアップを 30 分間放置します。

最適なバッファー温度を維持するために、電気泳動タンクの下に冷凍冷却パックを置きます。次に、氷冷電気泳動作業溶液をタンクに加え、スライドキャリアをタンクに移します。ゲルを含むセルがカソードを向くようにスライドの向きを合わせます。

スライドを電気泳動タンクで20分間インキュベートし、DNAを巻き戻します。次に、電源をオンにして、1.19ボルト/センチメートルで20分間電気泳動を実行します。電気泳動が完了したら、電源を切り、スライドキャリアを電気泳動タンクから取り外します。スライドキャリアをティッシュペーパーの上で30秒間排出します。

次に、スライドキャリアを中和バッファーの入った皿に入れ、20分間放置します。その後、氷冷の二重蒸留水を入れた洗器に入れ、20分間放置します。洗浄後、スライドキャリアを水から取り出し、スライドを摂氏37度のインキュベーターで1時間乾燥させます。

スライドを水和するには、スライドキャリアを氷冷の二重蒸留水を入れた洗浄皿に移し、30分間放置します。次に、スライドキャリアを1ミリリットルあたり2.5マイクログラムのヨウ化プロピジウム溶液を含む染色皿に入れます。

染色皿の蓋を閉め、室温で暗所で20分間インキュベートします。インキュベーション後、スライドキャリアを別の皿に移し、氷冷の二重蒸留水で20分間洗浄します。

スライドキャリアを皿から取り外し、摂氏37度のインキュベーターまたは室温で暗所で完全に乾燥させます。スライドが完全に乾いたら、画像解析の準備が整うまでスライドボックスに入れて暗所に保管します。