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アミノ酸トランスポーターは、細胞膜を越えたアミノ酸の移動を媒介し、重要な細胞プロセスを調節する膜結合タンパク質です。
invitroでアミノ酸の取り込みを研究するには、マウス骨髄由来間質細胞の培養を採取します。成長培地を吸引します。放射性水素で標識されたグルタミン(アミノ酸)を添加した予熱した緩衝液を追加します。必要な期間インキュベートします。
予熱されたバッファーは、グルタミンの細胞取り込みに必要な生理学的温度と適切なpHを提供します。グルタミントランスポーターは、ナトリウムイオン共役共輸送を介して基質転座を担う輸送ドメインと、膜固定足場ドメインで構成されています。
輸送ドメインは、バッファーからのナトリウムイオンとともに放射性標識グルタミンに結合します。結合すると、分子を細胞質に放出します。同時に、輸送ドメインは細胞内のナトリウムイオンと中性アミノ酸を細胞外に転座させ、細胞の恒常性をもたらします。
細胞を氷冷バッファーで洗浄し、反応を終了し、細胞外放射性標識グルタミンを除去します。洗剤溶液を追加します。界面活性剤は細胞を溶解し、細胞内放射性標識グルタミンの放出を引き起こします。
ライセートを遠心分離します。グルタミン含有上清をシンチレーションカクテルの入ったバイアルに加え、バイアルをシンチレーションカウンターに入れます。
放射性標識グルタミン分子は、高エネルギーのベータ粒子を放出します。カクテルのシンチレータは粒子を吸収し、シンチレーションカウンターによって検出される光パルスを放出します。
放射能を測定して細胞のグルタミン取り込みを推定します。
アミノ酸取り込みアッセイを開始するには、FBS、ペニシリン、およびストレプトマイシンを添加したα-MEM培地中の12ウェル組織培養プレートの各ウェルに、5 x 104 ST2細胞をプレートします。細胞の余分なウェルをプレートして、正規化の条件ごとの細胞数を定量化します。
次に、摂氏37度の加湿細胞培養インキュベーターで5%の二酸化炭素とともに、コンフルエントするまで2〜3日間細胞をインキュベートします。インキュベーション後、培地を吸引し、pH 7.4で1ミリリットルのPBSで細胞を2回洗浄します。次に、PBSを吸引してから、1ミリリットルのクレブスリンガーHEPES(KRH)で細胞を一度洗浄します。
細胞を、1ミリリットルあたり4マイクロキュリーを含む新しく調製したKRHの0.5ミリリットルのL-[3,4-3 H]-グルタミン作業培地で5分間インキュベートします。インキュベーション後、放射性媒体を収集して廃液容器に分配します。次に、氷冷のKRHで細胞を3回洗浄して反応を終了します。
次に、1ミリリットルの1%ドデシル硫酸ナトリウムを各ウェルに加え、混合物を10回粉砕して細胞を溶解および均質化します。次に、細胞溶解物を1.5ミリリットルのチューブに移し、最低速度10,000 gで10分間遠心分離して溶解物を清澄
化します。上清を8ミリリットルのシンチレーション溶液を含むシンチレーションバイアルに移し、シンチレーションカウンターを使用して放射能を毎分カウントで読み取ります。
細胞の残りの非放射性プレートから、細胞をトリプシン化、再懸濁、およびカウントして、溶解した放射性培養物の細胞数を推定します。血球計算盤を使用して、実験条件ごとに非放射性ウェルあたりの細胞数をカウントします。