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ピルビン酸の細胞レベルは、エネルギーを生成する生化学的経路の重要な中間体であり、酵素ベースの比色アッセイを使用して推定できます。
非寄生性線虫であるCaenorhabditis elegansの細胞内のピルビン酸レベルを決定するには、ピルビン酸を含む成虫から調製された細胞画分を取ります。溶液を処理して細胞タンパク質を除去し、ピルビン酸を含む清澄化された細胞画分(試験サンプル)を収集します。細胞タンパク質がないため、ピルビン酸レベルの正確な測定が保証されます。
まず、酵素ピルビン酸オキシダーゼと西洋わさびペルオキシダーゼ、および発色色素を含む作業試薬を追加します。混合物を暗所で十分な時間インキュベートします。
インキュベーション中、ピルビン酸オキシダーゼはピルビン酸(その基質)と反応し、副産物として過酸化水素を生成します。光がないと、過酸化水素の自然分解が防止されます。
西洋わさびペルオキシダーゼは、過酸化水素と発色染料の間の反応を触媒し、着色された製品を生成します。着色反応生成物の強度は、サンプル中のピルビン酸濃度に正比例します。
インキュベーション期間が終了したら、サンプルをプレートリーダー内に置き、吸光度を測定します。既知のピルビン酸濃度で連続希釈を使用して標準曲線を生成します。
試験サンプルの測定された吸光度値を曲線にプロットして、試験サンプル中のピルビン酸濃度を決定します。
比色アッセイキットを使用して、試験サンプル中のピルビン酸の濃度を測定し、二重検査を実施します。
10マイクロリットルの試験サンプルを96ウェルプレートの異なるウェルに加え、90マイクロリットルの作業試薬を各サンプルに加えます。蓋をして室温で30分間インキュベートします。次に、プレートをマイクロプレートリーダーに入れて、570ナノメートルで各ウェルの吸光度を測定します。
ピルビン酸標準曲線をプロットし、各濃度に2.25を掛けて標準曲線からピルビン酸濃度を計算します。