0 閲覧数 • 4:00 分 • July 8th, 2025
グリコーゲン合成に重要な酵素であるグリコーゲンシンターゼは、ウリジン二リン酸グルコース、またはヌクレオチド糖であるUDP-グルコースをUDPとグリコシル残基に切断し、放出されたグルコースモノマーを成長中のグリコーゲン鎖に追加します。
グリコーゲンシンターゼ活性を推定するには、まずグリコーゲン、UDP-グルコース、ATP、ホスホエノールピルビン酸、およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)を含む反応混合物をチューブに取り入れます。ヌクレオシド二リン酸(NDP)、キナーゼ酵素、ピルビン酸キナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼ酵素カクテルを加えます。内容物を混ぜ合わせ、インキュベートします。
グリコーゲンシンターゼ含有サンプルをチューブに加えて酵素反応を開始します。
グリコーゲンシンターゼはUDP-グルコースに作用し、UDPとグリコシル残基を生成します。酵素は遊離グルコースモノマーを取り込み、反応混合物のグリコーゲン鎖に取り込みます。ATPの存在下では、反応混合物のNDPキナーゼが未使用のUDPをリン酸化し、UTPに変換してADPを生成します。
酵素ピルビン酸キナーゼはADPに作用し、反応混合物のホスホエノールピルビン酸によって供与されたリン酸を添加してATPとピルビン酸を生成します。次に、乳酸デヒドロゲナーゼはピルビン酸を乳酸に変換し、反応中にNADHを酸化します。
340 nmでのNADH吸光度の低下を測定して、酵素活性の成功を示すNADHの消費量を定量化します。
グリコーゲンシンターゼ活性の測定から始めるには、以前に調製したUDP-グルコース、ATP、ホスホエノールピルビン酸、およびNDPキナーゼのストック溶液を氷上で解凍します。ウォーターバスを摂氏30度に予熱します。
ストック溶液の準備ができたら、テキストプロトコルに記載されているように、試薬を15ミリリットルのチューブに添加することにより、グリコーゲンシンターゼアッセイの数に応じて十分なアッセイ混合物を調製します。
反応混合物のNADHを水に置き換えてブランク反応を調製し、反応を使い捨てのメタクリレートキュベットに移します。ブランク反応を使用して、分光光度計の波長340ナノメートルの「ゼロ」を設定します。
反応混合物の770マイクロリットルのアリコートを1.5ミリリットルのチューブに入れ、NDPキナーゼとピルビン酸キナーゼ/乳酸デヒドロゲナーゼ混合物をそれぞれ2マイクロリットルずつチューブに順次加えます。
穏やかに混合した後、チューブを摂氏30度のウォーターバスで3分間インキュベートし、反応混合物を予熱します。次に、グリコーゲンシンターゼを含むサンプル30マイクロリットルを、pH 7.8の20ミリモルトリスバッファーに加え、穏やかに混合してから、反応混合物を使い捨てのメタクリレートキュベットに移します。
キュベットを分光光度計に入れ、340ナノメートルで10〜20分間の時間間隔で吸光度を記録します。次に、得られた吸光度を時間に対してプロットします。