インフルエンザウイルスの感染の多様性を測定するためのインピーダンスベースの細胞アッセイ

インフルエンザウイルス感染中、ウイルスはエンドサイトーシスによって細胞に侵入し、宿主細胞機構を乗っ取り、子孫ビリオンを生成します。これらは放出され、隣接する細胞に感染し、一連の感染を引き起こします。

培養中の感染性インフルエンザウイルスと細胞の比率(感染の多重度)を測定するには、新たに入手した哺乳類細胞懸濁液の適切な密度をマイクロタイタープレートに加えます。

プレートには、ウェル底部に埋め込まれたインピーダンス測定金微小電極が含まれています。インキュベートし、細胞がウェルの底に付着し、感染前の指数関数的な成長段階に到達できるようにします。

微小電極の間に小さな電位を印加します。微小電極に付着したセルは絶縁体として機能し、電流の流れを制限し、測定される電気抵抗(インピーダンス)を増加させます。

メディアを取り出します。インフルエンザウイルス懸濁液をウェルにピペットで入れます。適切なセリンエンドプロテアーゼを補給します。

インキュベーション中、セリンエンドプロテアーゼはウイルス糖タンパク質血球凝集素を切断して活性化し、特定の宿主細胞受容体への結合とその後のウイルス細胞への侵入を促進します。

宿主細胞機構を使用して、新しいウイルス粒子が生成および放出され、隣接する細胞に感染します。その結果、ウイルスに感染した細胞は形態学的変化を起こし、細胞変性効果を示し、細胞死につながり、細胞が微小電極表面から剥離し、時間の経過とともにインピーダンスが減少します。

インピーダンスがウイルス添加前の初期インピーダンスの半分に減少するのにかかる時間を決定します。期間が短いほど、ウイルス感染の多様性が高いことを示唆しています。

CIT₅₀値と感染の多様性との相関関係を決定するために、3 x 10⁴ 新たに分割されたMDCK細胞を電子マイクロタイタープレートの各壁に24時間培養した後、洗浄ごとにウェルあたり100マイクロリットルの新鮮なウイルス増殖培地で細胞を2回洗浄し、シングルチャネルピペットを使用して各ウェルに100マイクロリットルのウイルス懸濁液を追加します。

すべてのウイルス希釈液が添加されたら、プレートを摂氏35度で装置のクレードルポケットにそっとロードし、示されているように、少なくとも100時間、15分ごとにセルインピーダンスのモニタリングを開始します。

2サイクルの測定の後、装置をクリックして「一時停止」し、クレードルからEプレートを取り外します。TPCK-トリプシンを添加した100マイクロリットルのウイルス増殖培地を各ウェルに加え、Eプレートプレートをクレードルポケットに戻します。次に、解析を開始します。