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細胞は代謝プロセス中に低レベルのフリーラジカルを生成します。
病的状態では、フリーラジカルの過剰産生が起こり、酸化ストレスを引き起こします。これらのフリーラジカルは、脂質過酸化と呼ばれるプロセスで細胞膜リン脂質の多価不飽和脂肪酸を攻撃します。これにより、脂質ヒドロペルオキシドやマロンジアルデヒド (MDA) などの有毒な酸化生成物が形成され、膜損傷や細胞死を引き起こします。
チオバルビツール酸反応性物質(TBARS)アッセイを使用してin vitroでヒト血清中の酸化ストレスを検出するには、酸化誘導化合物で処理されたヒト血清を含むチューブから始めます。処理された血清は、主に脂質過酸化生成物(MDAおよび脂質ヒドロペルオキシド)と、リン脂質、脂質、およびタンパク質で構成されています。
次に、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を加えて混合し、脂質を可溶化し、MDAを放出します。SDSは汚染タンパク質を変性させます。適切な酸性緩衝液を加え、続いて酸性チオバルビツール酸(TBA)を加えます。高温でインキュベートします。
酸性条件および高温下では、TBA 分子は MDA と反応し、TBARS と呼ばれる安定した赤ピンク色の MDA-TBA 複合体を形成します。氷上でインキュベートして反応を止め、既存の複合体を安定させます。
遠心機。MDA-TBA含有上清を収集し、マルチウェルプレートに移します。マイクロプレートリーダーを使用して、複合体の吸光度を測定します。
吸光度が高いほど、TBARS濃度が高いことを示唆しており、これは血清中の脂質過酸化生成物と酸化ストレスのレベルが高いことを示しています。
分析するサンプルのガラス管にラベルを付け、準備したサンプルを各チューブに100マイクロリットル加えます。各サンプルに200マイクロリットルの8.1%SDSを加え、ガラス管を円を描くように穏やかに回転させて混合します。
各サンプルに1.5ミリリットルの3.5モル酢酸ナトリウムバッファーを加えます。次に、1.5ミリリットルの0.8%チオバルビツール酸水溶液を加えます。700マイクロリットルの脱イオン水を加えて、各チューブの最終容量を4ミリリットルにします。ガラス管にしっかりとキャップをし、摂氏95度に設定した加熱ブロックで1時間インキュベートします。結露を防ぐために、チューブをアルミホイルで覆います。次に、チューブをブロックから取り出し、氷上で30分間インキュベートします。
インキュベーション後、サンプルと標準試料を摂氏4度で10分間、1,500 x g で遠心分離します。各チューブから150マイクロリットルの上清を96ウェルプレートのウェルに移し、ピペットチップで気泡を取り除きます。
532ナノメートルでサンプルの吸光度を測定します。次に、ブランクサンプルの平均吸光度の読み取り値を他のすべての吸光度の読み取り値から差し引きます。
標準曲線を作成し、それを使用して未知のサンプル濃度を計算します。