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哺乳類の目では、強膜と網膜の間に位置する脈絡膜には、血管周囲マクロファージと脈絡毛細血管(網膜に酸素と栄養素を供給する周皮細胞で裏打ちされた毛細血管の層)が含まれています。脈絡毛細血管からの異常な血管の発芽は、いくつかの血管性眼疾患で発生します。
ex
vivoで発芽する調節不全の脈絡毛細血管を研究するには、強膜と網膜色素上皮(RPE)に付着した脈絡膜を含む採取されたマウスの眼の外植片を採取します。
基底膜抽出物、またはBME(細胞外マトリックスタンパク質が豊富なヒドロゲル)の液滴をマルチウェルプレートのウェルに加えます。外植片を液滴に入れ、組織が平らにならないようにします。BMEを固めます。
内皮細胞またはEC特異的成長因子を添加した培地を追加します。インキュベート。RPE は血管内皮増殖因子を分泌し、EC 特異的成長因子とともに毛細血管 EC 増殖を刺激します。
固化したBMEは細胞外マトリックスを形成し、増殖するECを促進して発芽する毛細血管様尿細管を形成します。周皮細胞は移動してこれらの発芽毛細血管に付着し、毛細血管ECの成熟を促進します。
発芽領域の活性化されたマクロファージは酵素を分泌して、最も内側の脈絡膜層であるブルッフ膜を消化し、芽がRPEに移動できるようにします。
顕微鏡下で、発芽した毛細血管を視覚化します。適切なソフトウェアを使用して、脈絡膜の芽が覆う領域を測定します。
脈
絡膜発芽領域が大きいほど、外植片で進行性の脈絡毛細血管が発芽していることを示します。
解
凍したBMEを30マイクロリットルを24ウェル組織培養プレートの各ウェルの中央に加えます。BMEの液滴が端に触れずにプレートの底に凸状のドームを形成していることを確認してください。
組織をBMEの中央に置きます。脈絡膜外植片を平らにしないでください。BME内で組織を膨張させます。プレートを摂氏37度で10分間インキュベートし、ゲルを固化させます。次に、500マイクロリットルの完全な古典培地を各ウェルに加えます。クラシックメディアを一日おきに交換します。
脈絡膜の発芽は、顕微鏡で3日後に観察できます。脈絡膜発芽画像を画像Jで開き、「画像|タイプ |グレースケールの 8 ビット」です。次に、「画像 |調整 |明るさ/コントラスト」と調整します。
「
魔法の杖」機能を使用して、もやしの中央にある脈絡膜組織の輪郭を描き、除去します。無料の選択ツールを使用して画像の背景を削除します。
次に、「画像 |調整 |しきい値」と入力し、「しきい値」機能を使用して、背景と周辺に対する微小血管の芽を定義します。「F2」をクリックすると概要が表示されます。「保存」をクリックすると、選択した領域の画像が元の画像と同じフォルダーに保存され、後で参照できるようになります。
サンプルのグループが測定された後、分析のために記録されたデータをコピーします。