細胞内のタンパク質リン酸化をモニタリングするための時間分解Forster共鳴エネルギー移動

特定の細胞タンパク質のリン酸化は、それらの活性化または不活性化につながる重要な調節メカニズムです。

特定のタンパク質リン酸化を監視するには、接着細胞を含む培養プレートを取ります。細胞内のタンパク質のリン酸化を促進するために、刺激剤で細胞を処理します。使用済み培地を吸引し、細胞溶解バッファーとホスファターゼ阻害剤カクテルを加えます。

緩衝成分は細胞溶解を引き起こし、リン酸化タンパク質および非リン酸化タンパク質とともに細胞内容物を放出します。阻害剤カクテルは細胞ホスファターゼを不活性化するため、リン酸化タンパク質は無傷のままです。

細胞ライセートを低容量検出プレートに移します。異なる光感受性蛍光色素に結合したドナー抗体とアクセプター抗体でライセートを処理します。

インキュベーション中、ドナー抗体は試験タンパク質上の特定のエピトープを認識し、タンパク質のリン酸化および非リン酸化バリアントに結合できるようにします。対照的に、アクセプター抗体は、リン酸化型の試験タンパク質にのみ結合します。

この結合により、アクセプター蛍光色素はリン酸化タンパク質変異体のドナー蛍光色素に近づきます。この近接性により、フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)がトリガーされます (2 つの光感受性蛍光色素間の距離依存エネルギー移動現象)。

FRET 互換のマイクロプレートリーダーでプレートを読み取ります。

照明を受けると、ドナー蛍光色素は励起されます。これにより、アクセプター分子へのエネルギー移動が引き起こされ、アクセプター分子は細胞内のテストタンパク質のリン酸化レベルと相関する長寿命の蛍光シグナルを放出します。

アッセイを実行するには、事前に最適化された密度で50マイクロリットルの細胞を、適切な培地中の96ウェル組織培養処理プレートに分注します。次に、摂氏37度、二酸化炭素5%のインキュベーターで一晩インキュベートします。

翌日、ポリプロピレン96ウェルプレートの12ウェルにわたって、無血清培地で化合物を連続希釈することにより、試験化合物の中間2倍および4倍希釈シリーズを調製します。細胞刺激のために、刺激剤を2倍の濃度で含む50マイクロリットルの無血清培地を加え、室温または37度で事前に最適化された時間細胞をインキュベートします。

細胞阻害の場合は、阻害剤を含む無血清培地を4倍の濃度で25マイクロリットル添加し、室温または37度で事前に最適化された時間細胞をインキュベートします。次に、刺激因子を含む25マイクロリットルの無血清培地を4倍の濃度で添加し、事前に最適化された時間インキュベートします。次に、細胞を溶解するために、1X添加された溶解バッファーを修復し、ホスファターゼ阻害剤カクテルを添加します。

細胞培養培地を慎重に取り出して廃棄した後、調製した1X添加溶解バッファー50マイクロ