ニューロン上の試験化合物の神経毒性を評価するための発光ベースのアッセイ

神経突起の成長(ニューロンが突起を発達させる場所)は、神経機能と再生にとって非常に重要です。

神経突起増殖促進試験化合物の神経毒性効果をin vitroで評価するには、ヒト神経前駆細胞、hNPC、分化培地中の懸濁液を入手します。

ポリ-L-リジンとラミニンでコーティングされたマルチウェルプレートウェルに細胞を播種し、ウェル底への細胞の付着を促進し、細胞の増殖をサポートします。分化培地成分は、ニューロンへのhNPC分化を促進します。

1セットのウェルを神経突起増殖促進試験化合物で処理します。これは hNPC 由来のニューロンと相互作用し、細胞代謝プロセスとその後の主要な細胞エネルギー源であるアデノシン三リン酸 (ATP) の濃度を混乱させることなく、神経突起の成長を誘導する可能性があります。

界面活性剤、ルシフェラーゼ酵素、ルシフェラーゼ基質、ルシフェリン、ATPアーゼ阻害剤を含むシングルステップ試薬をマグネシウムイオンとともに加え、混合します。

界面活性剤は細胞膜を破壊し、その結果、細胞溶解と細胞内ATPが溶液に放出されます。ATPアーゼ阻害剤は、放出された内因性ATPアーゼを阻害し、ATP測定を妨げる可能性があります。遠心分離機、細胞破片の沈殿。

インキュベーション中、マグネシウムイオンとともに放出されたATPにより、ルシフェリンがルシフェラーゼに結合し、その結果、ルシフェリンが高励起オキシルシフェリンに酸化され、基底状態に弛緩すると生物発光光子が放出されます。マイクロプレートリーダーを使用して、ATP濃度を示す発光を測定します。

ATP濃度が高いほど、細胞生存率が高く、ニューロンに対する有意な試験化合物毒性がないことを示唆しています。

プレートをコーティングするには、384ウェルプレートの各ウェルに30マイクロリットルのポリ-L-リジンを加え、プレートを室温で1時間インキュベートします。PBSで2回洗浄し、約30分間乾燥させます。

各ウェルに30マイクロリットルのラミニンを加え、プレートを摂氏37度で2時間インキュベートします。PBSで洗浄を繰り返し、細胞のプレーティングを続行します。25マイクロリットルの分化培地に20,000個の単一細胞神経球を384ウェルプレートの各ウェルに加え、プレートを摂氏37度で5日間インキュベートします。

単一の細胞に分解された神経球の正確な数をプレーティングするには、高精度のピペッティングスキルが必要です。したがって、より再現性の高い結果を得るために、プレーティングの前に神経球をニューロンに分化することをお勧めします。

インキュベーション後、5マイクロリットルの試験化合物を所望の濃度の6倍で各ウェルに加え、細胞をさらに24時間インキュベートします。

細胞生存率アッセイを実行するには、各ウェルに30マイクロリットルの発光試薬を加え、プレートをシェーカーに2分間放置します。プレートを300〜400倍gで30秒間遠心分離します。次に、プレートを光から保護しながら室温で10分間インキュベートします。インキュベーション後、マイクロプレートリーダーで発光を測定します。