JoVE 実験百科事典
生物学的技法
0 回視聴 • 4:02 分 • July 8th, 2025
タンパク質間相互作用は、重要な細胞機能にとって重要です。
膜貫通タンパク質(細胞膜の脂質二重層にまたがる膜タンパク質)間の相互作用を研究するには、接着した哺乳類細胞培養物を含むマルチウェルプレートのウェルから始めます。
次に、適切なトランスフェクション剤と一対の発現プラスミドを含む溶液を追加します。
発現プラスミドの1つは、ルシフェラーゼ酵素の小さな非機能フラグメントに融合した目的の膜貫通タンパク質をコードし、もう1つのプラスミドは、ルシフェラーゼ酵素の大きな非機能フラグメントに融合した目的の2番目の膜貫通タンパク質をコードします。
プレートをインキュベートします。トランスフェクション剤は、発現プラスミドの細胞取り込みを促進します。
トランスフェクトに成功した細胞は膜貫通タンパク質を発現します。発現した膜貫通タンパク質間の相互作用により、細胞質に面した大小の断片が近接し、それらが結合して活性ルシフェラーゼ酵素を形成します。
背景発光を最小限に抑えるために、ウェル内の培地を無血清培地に交換します。フリマジン(細胞透過性ルシフェラーゼ基質)溶液を加えます。フリマジンが細胞に入り、その後ルシフェラーゼがフリマジンを酸化し、高強度の発光を生成します。
マイクロプレートリーダーを使用して、膜貫通タンパク質間の強い相互作用を示唆する発光を測定します。
トリプシン処理によって接着HEK293T細胞培養物を回収し、専用の完全増殖培地に細胞を再懸濁します。細胞を透明な底、白い面、96ウェルプレートにプレートします。ウェルの総数を調整して、反復を含むすべてのテスト済みの組み合わせとコントロールに対応します。次に、標準的な条件で細胞を一晩培養します。
翌日、発現プラスミドの所望の組み合わせで細胞をトランスフェクトします。プラスミドを無血清培地で各コンストラクトのマイクロリットルあたり6.25ナノグラムに希釈し、脂質ベースのトランスフェクション試薬を適切な脂質とDNAの比率で添加します。
製造元の指示に従ってプラスミドをインキュベートします。次に、8マイクロリットルの脂質-DNA混合物を指定されたウェルに加えます。プレートの内容物を穏やかに回転させながら混合し、標準条件で細胞を20〜24時間培養します。
翌日、各ウェルのコンディショニング培地を100マイクロリットルの無血清培地に交換し、培地交換時に細胞が剥離しないようにします。
発光を測定する直前に、1 容量のフリマジンと 19 容量の希釈バッファーを混合します。25マイクロリットルのフリマジン作業溶液を各ウェルに加え、プレートを手で、またはオービタルシェーカーで穏やかに混合します。
プレートを発光マイクロプレートリーダーに挿入し、プレートを摂氏37度で10〜15分間平衡化します。分析するウェルを選択し、0.3秒の積分時間で発光を読み取ります。必要に応じて、最大2時間発光を監視し続けます。