JoVE 実験百科事典
生物学的技法
0 回視聴 • 4:34 分 • July 8th, 2025
デジタル液滴PCRは、DNA内のヌクレオチドのランダムな挿入または欠失であるインデル変異を検出します。これは、サンプルを小さな液滴に分割し、各液滴の DNA を独立して増幅することによって実現されます。
ddPCRを実行するには、標的遺伝子の野生型および変異変異体を含むDNAサンプルを採取します。サンプル混合物とオイルを、マイクロ流体チャネルを含む液滴発生器チャンバーの別々のコンパートメントにロードします。
サンプルとオイルは狭いチャネルを通って急速に流れ、接合部で乳化し、それぞれが数個のDNA分子を含むいくつかの液滴に分割されます。
次に、順方向および逆方向のプライマー、dNTP、耐熱性DNAポリメラーゼ、および異なる蛍光色素とクエンチャー分子でタグ付けされた2つのプローブを含むバッファーを含むPCRプレートを取ります。各プローブは、特定のタイプの対立遺伝子(野生型または変異型)に特異的です。
液滴をPCRプレートに移します。プレートをサーモサイクラーに入れ、反応を実行します。変性中に、DNA鎖が分離します。アニーリング温度では、プライマーとプローブはテンプレートDNAにアニールします。
緑色とオレンジ色の蛍光色素を持つプローブは、それぞれ野生型と変異型のDNA配列に結合します。その後、DNAポリメラーゼはプライマーを伸ばし、プローブから蛍光色素分子と消光分子を切断し、蛍光シグナルを生成します。
増幅された生成物を分析します。緑色の蛍光を示す液滴には野生型DNA配列が含まれており、オレンジ色の蛍光はインデル変異を示します。
まず、ddPCRスーパーミックス、フォワードおよびリバースプライマー、HEXまたはFAMプローブ、DNA、および水を本文に記載されている割合で添加することにより、25マイクロリットルのデジタル液滴PCRまたはddPCRサンプルミックスを調製します。次に、ボルテックスして反応を完全に混合します。
50マイクロリットルのマルチチャンネルピペットを使用して、20マイクロリットルのddPCRサンプルミックスをカートリッジの中央の列にロードします。次に、200マイクロリットルのマルチチャンネルピペットを使用して、ピペッティング中に気泡を発生させることなく、70マイクロリットルのオイルを一番下の列にロードします。
中央の凹んだ部分を避けて、端だけに触れてガスケットを置き、プレートを液滴発生器にしっかりと置き、カバーを閉じて実行を開始します。
カートリッジの最上段から96ウェルプレートに浸漬ミックスを移すには、マルチチャンネルピペットを使用し、40マイクロリットルの液体サンプルを30〜45度の角度で3〜5秒間引き出します。次に、混合物を 3 度の角度で 45 秒以上ゆっくりとウェルに排出し、側面から下ろし、ピペットの 2 番目のストップに移動して液体
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