最適なアニーリング温度を決定するためのグラジエントポリメラーゼ連鎖反応

勾配ポリメラーゼ連鎖反応は、プライマー(配列特異的一本鎖DNA)がテンプレートDNA上の相補部位に結合するアニーリング温度を最適化する技術です。

フォワードプライマーとリバースプライマー、dNTP、および熱安定性DNAポリメラーゼを含む混合物を適切なバッファーに入れます。テンプレートDNAを加え、成分をPCRプレートに移します。

プレートを専用の加熱ブロックを備えた勾配サーマルサイクラーに入れます。これにより、55°Cから65°Cの範囲で焼きなまし温度の線形勾配が確立され、プレート全体で温度が一定に増加します。

反応によりプレートが高温で加熱され、二本鎖DNAが一本鎖に変性し、DNAポリメラーゼが活性化されます。その後、各ウェルのプログラムされた値に従って温度が下がり、プライマーの焼きなましが容易になります。

最適なアニーリング温度を下回ると、プライマーは変性DNAに非特異的に結合し、PCR反応中に非特異的増幅を引き起こします。最適な温度を超えると、不十分な量のプライマーがDNAに結合します。

最適な温度では、プライマーは標的DNAに特異的に結合します。次に、温度がわずかに上昇し、ポリメラーゼがdNTPを使用してプライマーを伸長できるようになります。これらの繰り返しの変性、アニーリング、および伸長サイクルは、DNA増幅につながります。

各ウェルで生成物を分析します。アニーリング温度が最適でないウェルは、増幅が少ないか、非特異的です。

最適なアニーリング温度は、DNAの最大の比増幅を生み出します。

グラジエントPCRを実行するには、まずマスターミックスを調製します。次に、96ウェルプレートで非テンプレートコントロール(NTC)用のマスターミックスを19マイクロリットル除去します。次に、残りのマスターミックスにテンプレートを追加します。20マイクロリットルのサンプル混合物を96ウェルプレートに分注します。サイクリングパラメータに従ってPCRを実行し、原稿に記載されているパラメータを使用して熱溶融プロファイルを生成します。