デュプレックスデジタルPCRによるデュアル遺伝マーカーの同時定量

0 views • 8:45 min • July 8th, 2025

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二本鎖デジタルポリメラーゼ連鎖反応(ddPCR)により、2つの異なる遺伝子マーカーを同時に定量的に検出できます。

まず、2つの異なる標的配列を含むサンプルを採取します。耐熱性DNAポリメラーゼ酵素、dNTP、および標的特異的プライマーを含む混合物を加えます。次に、蛍光レポーターとクエンチャー分子で標識された2つの異なる標的特異的オリゴヌクレオチドプローブを追加して、増幅された標的を検出します。

溶液を油で乳化して、標的配列を多数のナノ液滴に分配します。ターゲットを含む各液滴は、個々の反応容器として機能します。

個々のナノ液滴内の増幅反応の熱サイクルプロセスを開始します。

高い変性温度では、二本鎖ターゲットは一本鎖に分離します。

温度を下げて適切なアニーリング温度に達し、プライマーとオリゴヌクレオチドプローブがテンプレートに結合できるようにします。

クエンチャーが近接していると、レポーターの蛍光が抑制されます。伸長温度では、DNAポリメラーゼはプライマーを伸長させ、オリゴヌクレオチドプローブを切断します。結合していないレポーターは蛍光を発します。

液滴を液滴リーダー(蛍光検出システム)に通します。単一または二重蛍光の検出は、ターゲットを含む陽性の液滴を示し、シグナルがない場合は、陰性の液滴を示します。

パーティションの総数に対する陽性液滴の比率によって、標的配列の初期濃度が決まります。

この手順を開始するには、まず、プロトコルテキストに記載されているように、分子グレードの水とプローブ中の分子グレードの水とプローブの100マイクロモル/リットルのストック濃度を調製します。次に、適切な量のデジタルPCRミックス、フォワードおよびリバースプライマー、蛍光プローブ、およびヌクレアーゼフリー水を混合してマスターミックスを調製します。溶液に気泡が入らないように注意しながら、少なくとも10回上下にピペットで混合します。

dPCRマスターミックスは従来のqPCRマスターミックスよりも粘度が高いため、均一な溶液を作成するには、ピペッティングによる混合技術を使用する必要があります。これにより、下流での正確なdPCR定量が可能になります。

サンプル

を二重に実行するための液滴生成用のアッセイ混合物を作成するには、36マイクロリットルのマスターミックスを通常のPCRプレートにピペットで入れます。36マイクロリットルのマスターミックスのそれぞれに、12マイクロリットルのDNAテンプレートを混合し、対応する複製ウェルをプレート上に空のままにします。アッセイが適切に実行されていることを確認するために、ポジティブコントロールを含めます。テンプレートコントロールまたはNTCを含まないと、プレート内に汚染がないことを確認し、後でデータ分析のために蛍光ベースラインを設定します。

液滴発生器をセットアップする前に、マルチチャンネルピペットを使用してアッセイ混合物を混合し、混合物を上下に約15回ピペットします。混合物内に余分な気泡が発生しないように、ピペットチップが液体内にとどまるようにしてください。

次に、8 つのウェルを含むカートリッジ 1 を白いカートリッジ ホルダーに挿入し、カートリッジ ホルダーをカチッと閉じます。カートリッジ1は所定の位置にしっかりと固定され、液滴を発生させながらホルダーから外すことはできません。

マルチチャンネルピペットを使用して、気泡を発生させずに、20マイクロリットルのアッセイ混合物を「サンプル」とマークされたカートリッジの中央位置にそっと移します。70マイクロリットルの液滴生成オイルを「オイル」とマークされたカートリッジの左側にピペットで入れます。

カートリッジをガスケットで覆い、ガスケットが平らで、カートリッジの端に向かって 4 つの目盛りによって均等に保持されていることを確認します。液滴発生器の緑色に点灯したボタンを押してドアを開き、カートリッジを置きます。ボタンをもう一度押すと、発電機が閉じます。ドアが閉まると、緑色のボタンが淡色になり、ドアを再び開くことはできません。

液滴の生成はすぐに開始され、約1分間続きます。

液滴生成の進行中に、カートリッジ 2 を 2 番目の白いカートリッジ ホルダーに入れ、カートリッジ 1 と同じ方法で準備します。液滴の生成が完了すると、薄暗いボタンが緑色に変わります。

液滴発生器のドアを開けます。カートリッジ1が入っている白いカートリッジホルダーを取り外し、脇に置きます。カートリッジ2を液滴発生器に入れます。

カートリッジ1からガスケットを取り外し、廃棄します。白いカートリッジホルダーをクリックすると、新しく生成された液滴が破損する可能性があるため、クリックを外さないでください。

40マイクロリットルに設定されたマルチチャンネルピペットを使用して、チップを45度の角度でマークされた液滴のカートリッジの3番目の列に挿入し、すべての液滴をゆっくりとピペットで汲み上げます。ピペットチップをウェル壁の約半分に当て、液滴をゆっくりと排出することにより、それらを最終的なPCRプレートに移します。

同様に、カートリッジ2の液滴生成が完了したら、カートリッジ2からガスケットを取り外し、生成した液滴を最終的なPCRプレートに移します。プレートの上に穴を開けるホイルカバーを置き、プレートシーラーの上に置きます。シーラーを摂氏180度に設定します。シーラーの「再生」を押して10秒間シールします。

この手順を開始するには、密封された最終PCRプレートをサーマルサイクラーに入れます。最終的なPCRプレートと互換性があり、温度ランピング速度が毎秒2°Cのサーマルサイクラーを使用してください。

次のサーマル プログラムを実行します: 摂氏 95 度で 10 分間、その後摂氏 94 度で 30 秒、摂氏 60 度で 60 秒のサイクルを 40 回実行し、その後摂氏 98 度で 10 分間保持します。サイクルが完了したら、プレートを液滴リーダーに移して、各ウェル内の各液滴の蛍光を自動測定します。

液滴の読み取りを続行する前に、液滴が室温にあることを確認してください。まず、付属のソフトウェアを開いて液滴の読み取りを設定します。空の96ウェルプレートの回路図を含むデフォルトの「セットアップ」メニューで、ウェルA1をダブルクリックして、「サンプル」、「アッセイ1」、「アッセイ2」の3つのセクションを含むメニューを開きます。

サンプルセクションで、「名前」というラベルの付いたボックスにサンプルIDを入力し、右側の「適用」とマークされたボックスをオンにします。次に、「実験」というラベルの付いたドロップダウン メニューをクリックします。「まれなイベント検出」で「赤」を選択し、「Enter」をクリックします。

「A1」と示されているセクションに移動します。「名前」セクションで、アッセイに記入し、「Enter」をクリックします。下の「タイプ」というラベルの付いたボックスで、ドロップダウンメニューをクリックし、「チャンネル1不明を選択して、「Enter」をクリックします。

「A2」と示されたセクションに移動します。「名前」セクションで、アッセイに記入し、「Enter」をクリックします。下の「タイプ」というラベルの付いたボックスで、ドロップダウンメニューをクリックし、「チャンネル2不明を選択して、「Enter」をクリックします。

前の手順のすべての情報が井戸 A1 に存在します。

液滴を含む後続のすべてのウェルに名前を付けます。合計セットアップ時間を節約するには、「Shift」または「Control」をクリックして複数のウェルを同時に選択します。プレートのデジタル描写が物理プレートを反映している場合は、メニューの右下にある「OK」を押します。プレート回路図の上部に表示される新しいメニューの「テンプレート」セクションで、「名前を付けて保存」を選択し、プレートに名前を付けて保存します。

画面の左側にある「実行」をクリックし、ポップアップの「実行オプション」ウィンドウで適切な染料セットを選択します。データ収集が開始され、ソフトウェアにリアルタイムで表示されます。

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Last updated: 18 July 2026