デュプレックスデジタルPCRによるデュアル遺伝マーカーの同時定量

二本鎖デジタルポリメラーゼ連鎖反応(ddPCR)により、2つの異なる遺伝子マーカーを同時に定量的に検出できます。

まず、2つの異なる標的配列を含むサンプルを採取します。耐熱性DNAポリメラーゼ酵素、dNTP、および標的特異的プライマーを含む混合物を加えます。次に、蛍光レポーターとクエンチャー分子で標識された2つの異なる標的特異的オリゴヌクレオチドプローブを追加して、増幅された標的を検出します。

溶液を油で乳化して、標的配列を多数のナノ液滴に分配します。ターゲットを含む各液滴は、個々の反応容器として機能します。

個々のナノ液滴内の増幅反応の熱サイクルプロセスを開始します。

高い変性温度では、二本鎖ターゲットは一本鎖に分離します。

温度を下げて適切なアニーリング温度に達し、プライマーとオリゴヌクレオチドプローブがテンプレートに結合できるようにします。

クエンチャーが近接していると、レポーターの蛍光が抑制されます。伸長温度では、DNAポリメラーゼはプライマーを伸長させ、オリゴヌクレオチドプローブを切断します。結合していないレポーターは蛍光を発します。

液滴を液滴リーダー(蛍光検出システム)に通します。単一または二重蛍光の検出は、ターゲットを含む陽性の液滴を示し、シグナルがない場合は、陰性の液滴を示します。

パーティションの総数に対する陽性液滴の比率によって、標的配列の初期濃度が決まります。

この手順を開始するには、まず、プロトコルテキストに記載されているように、分子グレードの水とプローブ中の分子グレードの水とプローブの100マイクロモル/リットルのストック濃度を調製します。次に、適切な量のデジタルPCRミックス、フォワードおよびリバースプライマー、蛍光プローブ、およびヌクレアーゼフリー水を混合してマスターミックスを調製します。溶液に気泡が入らないように注意しながら、少なくとも10回上下にピペットで混合します。

dPCRマスターミックスは従来のqPCRマスターミックスよりも粘度が高いため、均一な溶液を作成するには、ピペッティングによる混合技術を使用する必要があります。これにより、下流での正確なdPCR定量が可能になります。

サンプル

を二重に実行するための液滴生成用のアッセイ混合物を作成するには、36マイクロリットルのマスターミックスを通常のPCRプレートにピペットで入れます。36マイクロリットルのマスターミックスのそれぞれに、12マイクロリットルのDNAテンプレートを混合し、対応する複製ウェルをプレート上に空のままにします。アッセイが適切に実行されていることを確認するために、ポジティブコントロールを含めます。テンプレートコントロールまたはNTCを含まないと、プレート内に汚染がないことを確認し、後でデータ分析のために蛍光ベースラインを設定します。

液滴発生器をセットア