ウイルス感染の診断のためのリアルタイム定量的逆転写PCR

リアルタイム定量逆転写PCRは、ウイルス感染の同定に役立ちます。

標的ウイルスRNAを含むサンプルから始めます。DNA合成と増幅の両方を助ける標的特異的プライマーを、逆転写酵素とdNTPとともに添加します。

耐熱性DNAポリメラーゼ(PCRサイクル全体でDNAを増幅するための酵素)と、二本鎖DNA(dsDNAに挿入する色素)であるSYBRグリーンを追加します。反応をサーマルサイクラーに入れます。プライマーが標的RNAに結合する適切な温度を設定します。

逆転写酵素は、プライマーにdNTPを追加すると同時に、テンプレートRNAを切断してcDNAを合成します。

温度を上げて、逆転写酵素を不活性化します。温度を下げて、プライマーをcDNAにアニールして、その後の増幅を行います。温度を上げて伸長ステップに到達し、そこでDNAポリメラーゼがプライマーを伸長させ、dsDNAを合成します。

連続したサイクルにより、指数関数的なdsDNA増幅が発生します。SYBRグリーンはDNAに結合する数が増え、蛍光発光が比例して増加します。サイクル全体で検出された蛍光シグナルをプロットします。

正の増幅曲線は、サンプル中にウイルスRNAが存在することを示します。

温度を段階的に上げて融解温度に達し、dsDNAを一本鎖に変性させます。結合した色素分子は放出され、蛍光を失います。温度に対する蛍光の減少をプロットします。

ウイルス特異的な融解温度に対応するピークは、ウイルス感染を確認します。

テスト

サンプルとコントロールサンプルの両方を考慮して、スプレッドシートを使用してPCRプレートのレイアウトを計画します。表面を消毒してPCRワークステーションを準備し、UVキャビネットを使用する場合は、開始の10分前にUVライトをオン

にします。

試薬とプライマーを冷凍庫から取り出して解凍しますが、酵素混合物は常に氷の上に保管してください。試薬を混合し、短時間遠心分離して液体を回収します。原稿の指示に従って、リッサウイルスとベータアクチンのPCRマスターミックスを調製します。マスターミックスは、使用する準備ができるまで氷の上に置いておきます。調製したマスターミックスを混合して遠心分離し、19マイクロリットルをPCR装置互換プレートまたはチューブストリップの関連するウェルに分注します。

別の部屋またはUVキャビネットで、準備したRNAを1マイクロリットル慎重に加えます。UVキャビネットを使用する場合は、開始の10分前にUVライトをオンにしてください。テストサンプルの後、ポジティブコントロールとテンプレートなしコントロールを追加します。

RNAをマスターミックスに添加するときは、正しいウェルに添加されていることを確認してください。プレート プランを使用して、この手順を支援します。

プレートを密封し、蓋がプレート