ウイルス感染の診断のためのリアルタイム定量的逆転写PCR

リアルタイム定量逆転写PCRは、ウイルス感染の同定に役立ちます。

標的ウイルスRNAを含むサンプルから始めます。DNA合成と増幅の両方を助ける標的特異的プライマーを、逆転写酵素とdNTPとともに添加します。

耐熱性DNAポリメラーゼ(PCRサイクル全体でDNAを増幅するための酵素)と、二本鎖DNA(dsDNAに挿入する色素)であるSYBRグリーンを追加します。反応をサーマルサイクラーに入れます。プライマーが標的RNAに結合する適切な温度を設定します。

逆転写酵素は、プライマーにdNTPを追加すると同時に、テンプレートRNAを切断してcDNAを合成します。

温度を上げて、逆転写酵素を不活性化します。温度を下げて、プライマーをcDNAにアニールして、その後の増幅を行います。温度を上げて伸長ステップに到達し、そこでDNAポリメラーゼがプライマーを伸長させ、dsDNAを合成します。

連続したサイクルにより、指数関数的なdsDNA増幅が発生します。SYBRグリーンはDNAに結合する数が増え、蛍光発光が比例して増加します。サイクル全体で検出された蛍光シグナルをプロットします。

正の増幅曲線は、サンプル中にウイルスRNAが存在することを示します。

温度を段階的に上げて融解温度に達し、dsDNAを一本鎖に変性させます。結合した色素分子は放出され、蛍光を失います。温度に対する蛍光の減少をプロットします。

ウイルス特異的な融解温度に対応するピークは、ウイルス感染を確認します。

サンプルとコントロールサンプルの両方を考慮して、スプレッドシートを使用してPCRプレートのレイアウトを計画します。表面を消毒してPCRワークステーションを準備し、UVキャビネットを使用する場合は、開始の10分前にUVライトをオン

試薬とプライマーを冷凍庫から取り出して解凍しますが、酵素混合物は常に氷の上に保管してください。試薬を混合し、短時間遠心分離して液体を回収します。原稿の指示に従って、リッサウイルスとベータアクチンのPCRマスターミックスを調製します。マスターミックスは、使用する準備ができるまで氷の上に置いておきます。調製したマスターミックスを混合して遠心分離し、19マイクロリットルをPCR装置互換プレートまたはチューブストリップの関連するウェルに分注します。

別の部屋またはUVキャビネットで、準備したRNAを1マイクロリットル慎重に加えます。UVキャビネットを使用する場合は、開始の10分前にUVライトをオンにしてください。テストサンプルの後、ポジティブコントロールとテンプレートなしコントロールを追加します。

RNAをマスターミックスに添加するときは、正しいウェルに添加されていることを確認してください。プレート プランを使用して、この手順を支援します。

プレートを密封し、蓋がプレート全体で平らであることを確認し、プレートを回転させてウェルの底にあるすべての液体を集めます。各ウェルに同じ量の液体があり、気泡が見えないことを確認してください。次に、サンプルをPCR装置に移します。

プログラムを開き、「解離」で「SYBR Green」を選択します。分析するウェルを選択し、サンプルタイプとして「不明」、蛍光色素として「SYBR」を選択します。プレートレイアウト上のウェルに、アッセイがリッサウイルスウェル用かベータアクチン用かなどのサンプル情報でラベルを付けます。

「熱プロファイル設定」をクリックし、原稿で指定されているように熱サイクル条件を変更します。「開始」をクリックし、ファイルを保存する場所を選択し、チェックボックスをオンにして実行の終了時にランプをオフにします。ランプのウォームアップ前に開始するオプションが表示されたら、[今すぐ実行]をクリックしますが、ランプのウォームアップに15分以内であることを確認してください。