一本鎖DNAを増幅するためのマイクロスフェアポリメラーゼ連鎖反応

Microsphere-PCRは、表面のオリゴヌクレオチドに結合したマイクロサイズの球を使用して、一本鎖DNAの優先的な増幅を可能にします。

マイクロスフェア-PCRを開始するには、テンプレート一本鎖DNA鎖、追加のヌクレオチドタグを備えたフォワードプライマー、耐熱性DNAポリメラーゼ、dNTP、および一本鎖オリゴヌクレオチドプローブを示すマイクロスフェアを含む反応混合物を取ります。

チューブをサーモサイクラーに入れ、定義された条件で実行します。

最初のサイクルでは、アニーリング温度で、テンプレートDNAがマイクロスフェア表面のプローブに結合し、テンプレートDNAがセンス鎖として機能します。伸長中、ポリメラーゼはDNAを伸長させ、二本鎖はマイクロスフェアに付着したままになります。

次のサイクルでは、変性中にテンプレートDNAがミクロスフェアから分離し、プローブ鎖を表面に結合させたままにし、新しい鎖のテンプレートとして機能します。

アニーリング中、タグ付きプライマーはアンチセンス鎖に結合します。その後、ポリメラーゼはそれを拡張して、ヌクレオチドタグを持つセンス鎖を合成します。

このサイクルを数回繰り返して、二本鎖汚染物質が付着したまま溶液に入るセンス一本鎖DNAの複数のコピーを生成します。

PCR産物をローディングバッファーを含むチューブに移します。生成物とマーカーをゲルの異なるウェルにロードし、アガロースゲル電気泳動を使用して分離します。

テンプレートDNAはかすかな低分子量バンドを形成し、強力な高分子量バンドは一本鎖DNA増幅を確認します。

倍

率40倍の光学顕微鏡による顕微鏡計数により、約25個のマイクロスフェアを取得します。これに続いて、テキストプロトコルで説明されているように、すべての試薬を組み合わせます。サンプルをサーモサイクラーに入れ、適切な条件下で不斉PCRを開始します。

対称PCR後の上清の収集は、マイクロスフェアで一本鎖DNAを生成するための主要なプロセスであるため、最も重要なステップの1つです。

増幅後、8マイクロリットルの6Xローディングバッファーを各サンプルに加えます。各サンプル15マイクロリットルを2%アガロースゲルにロードします。次に、1X TAEバッファー中で100ボルトで35分間電気泳動を行います。