変異型DNA配列の配列変動を決定するための高分解能メルティングPCR

高分解能融解ポリメラーゼ連鎖反応HRM-PCRは、二本鎖DNA、dsDNA配列の変異を高精度で検出します。

まず、不活性なTaqポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNTP)、および蛍光レポーター色素を含むマスターミックスから始めます。フォワードプライマーとリバースプライマーを追加します。混合物をPCRプレートのウェルにピペットで移動させます。

dsDNAテンプレートを追加します。プレートを密閉し、混合物の蒸発を防ぎます。PCRを開始します。

高い変性温度は、dsDNAを一本鎖DNA、ssDNAに変性させ、ポリメラーゼを活性化します。次に、反応をアニーリング温度まで冷却し、部位特異的な相補的な塩基対を介してssDNAへのプライマーの順方向および逆方向の結合を促進します。

活性化されたポリメラーゼが動員され、dNTP付加によってDNAプライマー二本鎖が拡張されます。

蛍光レポーター色素(飽和濃度で存在するdsDNA特異的色素)は、二本鎖全体内に挿入され、明るく蛍光を発します。二本鎖は複数のPCRサイクルを経て、いくつかのバリアントを含むフラグメントを生成します。

PCR後、時間の経過とともに反応温度を着実に再上昇させることにより、メルトカーブ分析を実行します。

ヌクレオチド配列によっては、バリアントを含む部位が最初に変性し、色素を放出する場合があります。残りの色素結合部位が飽和すると、色素は再挿入できず、蛍光強度が低下します。さらに、dsDNAは、増分加熱するとssDNAに解離します。

dsDNAの半分が鋭い蛍光でssDNAに変性する融解温度を特定します。増幅されたDNA断片の融解曲線のシフトは、サンプルのヌクレオチド配列の変動を識別します。

HRM-PCRプロトコルを実行するには、まず、DNAサンプルを1.5ミリリットルのチューブで水で10ナノグラム/マイクロリットルの濃度に希釈します。次に、解凍したプライマー溶液を1.5ミリリットルのチューブで水で同じ濃度の6マイクロモルに希釈します。HRM-PCRキット溶液を解凍し、ボルテックスして慎重に混合し、すべての内容物を確実に回収します。

DNA結合色素、塩化マグネシウム、および水を含む酵素混合物を含む3つのバイアルを微量遠心分離機で短時間回転させてから開きます。室温の1.5ミリリットルチューブで、テキストプロトコルに記載されているように、コンポーネントを使用して120マイクロリットル反応用のPCRミックスを調製します。ボルテックスで慎重に混ぜます。

分子生物学の優れた実践に従って、注意とナビゲーションを使用して作業することが重要です。

19マイクロリットルのPCR混合物を白いマルチウェルプレートの各ウェルにピペットで入れます。濃度調整したDNAテンプレートを1マイクロリットル加え、白いマルチウェルプレートをシーリングホイルで密封します。適切なアダプターを備えたマルチウェルプレート用のローターを備えた標準的なスイングバケット遠心分離機で、白いマルチウェルプレートを1500倍gで1分間遠心分離します。白いマルチウェルプレートをHRM-PCR装置にロードします。テキストプロトコルにあるPCR条件でHRM-PCRプログラムを開始します。

HRM-PCR反応に続いて、テキストプロトコルに記載されているように、HRM分析を実行してCR1長多型を決定します。