白血球におけるDNAメチル化を検出するためのマルチプレックス液滴ポリメラーゼ連鎖反応

DNAシトシン残基のメチル化は、白血球または白血球の特徴です。

マルチプレックス液滴ポリメラーゼ連鎖反応(mdPCR)により、白血球内の複数のメチル化DNA領域を同時に同定できます。

反応バッファー、DNAポリメラーゼ、ヌクレアーゼフリー水を含む混合物を調製します。各ターゲット領域に特異的な順方向および逆方向のプライマーと蛍光加水分解プローブを追加します。プローブは、蛍光発出を阻害するためにクエンチャーに結合した異なる色の蛍光色素レポーターで構成されています。

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硫酸水素塩変換DNAを追加すると、メチル化されていないシトシンは脱アミノ化されてウラシルに変わりませんが、メチル化シトシンは変化しません。混ぜる。

ガラスシリンジにキャリアオイルと界面活性剤の混合物を充填し、別のシリンジにキャリアオイルとPCRの混合物を充填し、それらをマイクロ流体液滴発生器に接続します。キャリアオイルと水性のPCR混合物は、サブナノリットルサイズの液滴に乳化します。界面活性剤はエマルジョンを安定させ、液滴の融合を防ぎます。

液滴を採取し、PCRを行います。各液滴内では、高い変性温度により二本鎖DNAが一本鎖DNAに変性し、ポリメラーゼが活性化されます。反応温度が下がり、プライマーとプローブの部位特異的なアニーリングが可能になります。

ポリメラーゼがDNAプライマー二本鎖に結合して伸長すると、ウラシルはチミンとして増幅し、メチル化シトシンはシトシンとして増幅され、メチル化領域と非メチル化領域を区別できます。ポリメラーゼはさらにレポーターを切断してプローブから放出し、蛍光発光を引き起こします。

PCR後、顕微鏡下で液滴を視覚化します。蛍光色は、特定のメチル化DNA標的の存在を示します。

液滴生成には、1マイクロリットルの亜硫酸水素塩変換DNAをPCRチューブ内で新たに調製したプローブマスターミックスと混合し、短時間の遠心分離でサンプルを収集します。PEEK継手を使用して、使い捨て流体チューブを250マイクロリットル容量の精密ガラスシリンジ2本に接続し、1つの精密ガラスシリンジに5%のフッ素界面活性剤を含む250マイクロリットルのキャリアオイルを、1つの精密ガラスシリンジに50マイクロリットルのキャリアオイルを事前に充填します。

両方のシリンジが装填されたら、100マイクロリットルのPCR混合物をキャリアオイルのシリンジに装填し、高速カメラを備えた正立光学顕微鏡のステージに液滴マイクロ流体デバイスを配置します。

液滴形成をリアルタイムで観察および記録するには、事前に充填されたシリンジをプログラム可能なシリンジポンプに置き、フィッティング付きのPEEKユニオンを使用して、シリンジのチューブを液滴マイクロ流体デバイスのそれぞれの入口チャネルのチューブに接続します。

液滴発生器の出口から0.5ミリリットルのPCRチューブの内側にチューブを置き、シリンジポンプの流量を毎分2マイクロリットルに調整します。得られたエマルジョンを収集する前に、液滴のサイズが安定するまで待ちます。チューブの上部からゆっくりと慎重にエマルジョンを回収し、75マイクロリットルの溶液を200マイクロリットルのPCRチューブに移して熱サイクルします。

次に、PCRチューブ内の油分が分散相の体積と密接に一致していることを確認し、熱サイクル中の液滴の合体を防ぎ、200マイクロリットルのチューブをサーマルサイクラーに入れます。