組織溶解液中の標的タンパク質を推定するための定量的ドットブロット

定量的ドットブロット(QDB)は、サンプル中の標的タンパク質の濃度を定量するための有用な手法です。サンプルがポリマー膜に固定化されると、イムノブロッティングによってタンパク質を検出できます。

まず、QDBプレート(各ウェルの底にニトロセルロース膜が取り付けられたマルチウェルプレート)を取ります。サンプル(標的タンパク質を含む組織溶解物)をウェル内の膜の中心に追加します。

サンプルを乾燥させます。標的タンパク質は、非共有結合相互作用を介して膜に結合します。

ブロックソリューションを追加します。溶液中のタンパク質は膜上の非結合部位に付着し、検出試薬の非特異的結合を防ぎます。

次に、サンプル中の標的タンパク質に結合する一次抗体を含む溶液を追加します。結合していない抗体を洗浄して除去します。

次に、二次抗体溶液を追加します。ペルオキシダーゼ酵素で標識されたこれらの分子は、タンパク質結合一次抗体に結合します。結合していない抗体を洗浄して除去します。

最後に、化学発光基質と過酸化水素を含む溶液を加えます。過酸化水素を利用して、抗体結合ペルオキシダーゼが基質を酸化して発光します。プレートリーダーを使用して、サンプルの発光強度を測定します。

知の濃度の標的タンパク質で連続希釈を使用して、標準的な発光曲線を生成します。サンプルの測定された発光値を曲線上にプロットして、ターゲットタンパク質濃度を決定します。

この手順では、空のピペットチップボックスをQDBプレートの下に置き、プレートの底がテーブル表面に触れないようにします。最大2マイクロリットルのサンプルをQDBプレートの個々のユニットの底部にある膜中心にロードします。

ロード中は、QDBプレートの底面を表面に触れさせたり、個々のウェルにロードしすぎたりしないでください。あなたはウェルあたり4マイクロリットル以下の経験があります。

次に、ロードされたQDBプレートを室温で1時間放置するか、ロードしたプレートを摂氏37度で換気の良い空間で15分間放置します。プレートをブロックするには、QDBプレートを転写バッファーに浸し、10秒間軽く振ってください。

その後、QDBプレートをTBSTで3回穏やかにすすぎ、一定の振とう下でTBSTでプレートを5分間洗浄します。続いて、一定の振とう下でブロッキングバッファーでQDBプレートを1時間ブロックします。次に、一次抗体をブロッキングバッファーで選択した濃度で希釈し、通常の96ウェルプレートの個々のウェルに100マイクロリットル

QDBプレートを96ウェルプレートに挿入し、結合したプレートを室温で2時間、または摂氏4度で一定の振とう下で一晩インキュベートします。その後、プレートをTBSTで3回優しくすすぎ、TBSTで3回洗浄します--絶え間ない振とう下で毎回5分間。

次に、ブロッキングバッファーで二次抗体を選択した濃度で希釈し、100マイクロリットルを96ウェルプレートの各ウェルに分注します。次に、ロードされた96ウェルプレート内でQDBプレートを室温で一定の振とう下で1時間インキュベートします。QDBプレートをTBSTで3回穏やかにすすぎ、次に、一定の振とう下でTBSTでそれぞれ5分間、プレートを3回洗浄します。

定量のために、ECL基質を調製し、ウェルあたり100マイクロリットルで96ウェルプレートにアリコートします。次に、QDBプレートを96ウェルプレート内に挿入し、一定の振とう下で2分間挿入します。その後、96ウェルプレートからQDBプレートを取り外し、短く振って余分な液体を取り除きます。続いて、プレートを白いマイクロタイタープレートに置きます。次に、マイクロプレートリーダーの電源を入れ、ユーザーインターフェイスでカバー付きプレートを選択してから、結合したプレートをマイクロプレートリーダー内に置いて定量します。