細胞の不均一性を決定するためのシングルセルウェスタンブロッティング

炎症部位には、単球、マクロファージ、白血球などのさまざまな免疫細胞が含まれています。

単一細胞ウェスタンブロッティングによって不均一な細胞集団を同定するには、ブロックにパターン化された光活性化可能なポリアクリルアミドゲルからなる予め水和したブロッティングチップを取ります。各ブロックには多数のマイクロウェルがあります。複数のブロックにパターニングすると、複数のセルが並行してキャプチャされます。

不均一な細胞集団を含む懸濁液を追加します。ウェルの寸法により、単一のセルが沈降します。チップを適切なバッファーで満たされた電気泳動チャンバーに浸漬します。緩衝液中の界面活性剤分子は細胞膜を破壊し、細胞内容物を放出します。

電界を印加します。放出されたタンパク質はゲル内を移動し、異なるサイズのバンドに分離します。チップを洗浄バッファーで洗浄して、非特異的に結合した分子を除去し、目的のマーカータンパク質を含む細胞タンパク質のみを残します。

ゲルを紫外線にさらし、その表面を活性化し、タンパク質を固定します。

各細胞型に特有のマーカータンパク質に特異的に結合する一次抗体のカクテルを加え、タンパク質-一次抗体複合体を形成します。蛍光タグ付き二次抗体の混合物を分注し、それぞれの一次抗体に結合し、対応する細胞特異的マーカータンパク質を標識します。

チップをスキャナーに入れます。サンプル細胞懸濁液の単一細胞に特異的な対応するタンパク質マーカーの発現レベルに比例する蛍光強度を測定します。

シングルセルウェスタンブロット分析の場合は、10センチメートルのペトリ皿の底にある再水和したシングルセルウェスタンブロットチップに1ミリリットルの希釈したシングルセル懸濁液を加えます。5〜15分後、明視野顕微鏡下でチップを調べます。マイクロウェルの約15%から20%は単一のセルで占められ、ウェルの2%未満は2つ以上のセルを含む必要があります。

チップが適切にロードされている場合は、皿を45度傾け、チップを懸濁液バッファーで3回洗浄して、捕捉されていない細胞を取り除きます。最後の洗浄後、チップをゲル面を上にしてシングルセルウェスタン装置の電気泳動セルに慎重にロードし、シングルセルウェスタンブロットチップ全体を溶解/ランニングバッファーで覆います。細胞溶解を開始し、適切な実験パラメータに従って装置を実行します。

実行の最後に、室温で洗浄ごとに新鮮な洗浄バッファーを使用して10分間の洗浄を2回行い、チップをすすぎます。2回目の洗浄後、80マイクロリットルの目的の一次抗体溶液を抗体プロービングチャンバーに加え、抗体溶液がチップ全体を横切って吸い上げられるように、チップのゲル側を下に下げます。

室温で2時間後、チップを洗浄バッファーで3回、シェーカーで水で1回洗浄します。チップを適切な二次抗体とともに、光から保護した室温で1時間インキュベートします。インキュベーションの最後に、チップを洗浄バッファーで3回洗浄し、スライドスピナーでチップを回転させて、残りの洗浄バッファーを除去します。

シングルセルウェスタンブロットチップを剥がすには、50ミリリットルのチューブラックを摂氏60度のウォーターバスに入れ、ラックからわずか1センチメートル上に水を入れます。ヒュームフードで、40ミリリットルのストリッピングバッファーと320マイクロリットルのベータメルカプトエタノールをキャニスターに加えます。チップをキャニスター内の10センチメートルのペトリ皿に入れ、キャニスターをパラフィルムで密封します。

次に、キャニスターをウォーターバスのチューブラック内に置きます。90分後、チップを新しいペトリ皿に慎重に移し、チップを洗浄バッファーで1回短時間洗浄してから、15ミリリットルの新鮮な洗浄バッファーをペトリ皿に加え、シェーカーで15分間洗浄します。