JoVE 実験百科事典
生物学的技法
0 回視聴 • 3:35 分 • July 8th, 2025
死受容体であるCD95は、そのアゴニスト抗体に結合し、プロカスパーゼ8を動員する多タンパク質複合体である死誘導シグナル伝達複合体(DISC)の集合を引き起こします。DISCでは、プロカスパーゼ8が二量体化して処理され、さまざまな中間切断産物を形成し、最後にアポトーシスを開始する活性型
を形成します。化学発光ウェスタンブロッティングを使用してカスパーゼ-8プロセシングを分析するには、カスパーゼ8のDISC関連中間切断生成物を含むライセートをチューブに取ります。これをプロテインA-アガロースビーズ捕捉抗CD95抗体で補います。抗CD95抗体はDISC成分-CD95に結合し、タンパク質複合体を形成する
サンプルをSDS-ポリアクリルアミドゲルにロードし、異なるサイズの免疫沈降カスパーゼ8中間体を別個のバンドとして分離します。ゲルをブロッティングメンブレンの上に置き、電流を流します。カスパーゼ8中間体はゲルからブロッティングメンブレンに移動します。
膜をブロッキングタンパク質含有溶液で処理して、タンパク質結合部位を飽和させ、非特異的結合を防ぎます。
特定の部位でカスパーゼ-8産物に結合する一次抗体の溶液を追加します。
一次抗体の相補的なFc領域に特異的に結合する酵素タグ付き二次抗体を添加して、カスパーゼ-8切断産物-一次抗体-二次抗体複合体を形成します。
二次抗体結合酵素と反応して発光する化学発光基質を追加します。放出される光の強度は、カスパーゼ-8切断生成物の量と相関します。
ウェスタンブロットを実行するには、20マイクロリットルの4Xローディングバッファーをビーズに加え、摂氏95度で10分間加熱します。同時に、ライセートコントロールを摂氏95度で5分間加熱します。溶解物、免疫沈降物、およびタンパク質標準試料を12.5%SDSゲルにロードし、80ボルトの定電圧で実行します。
ゲル実行が完了したら、SDSゲルからタンパク質をニトロセルロース膜に移します。移写が完了したら、ブロットしたメンブレンを箱に入れ、穏やかに撹拌しながらブロッキング溶液中で1時間インキュベートします。次に、メンブレンをPBSTで5分間3回洗浄します。
タンパク質を検出するには、最初の一次抗体を指示された希釈でメンブレンに加え、穏やかに撹拌しながら摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、メンブレンを5分間のPBST洗浄を3回洗浄し、次に、20ミリリットルの二次抗体とともにメンブレンを室温で1時間穏やかに振とうしながらインキュベートします。
メンブレンをPBSTで再度3回洗浄します。最後のPBST洗浄を廃棄した後、約1ミリリットルの西洋わさび過酸化物基質を膜に加え、化学発光シグナルを検出します。