マウス胚性幹細胞ゲノムにおける相同組換えを検出するためのサザンブロッティング

サザンブロッティングでは、プローブベースの検出により、複雑なDNAミックスから特定のDNA配列を同定します。

サザンブロッティングでマウス胚性幹細胞の相同組換えまたはHRイベントを特定するには、細胞からゲノムDNAを取得します。制限酵素とインキュベートして、DNAをより小さなフラグメントに消化します。

DNAをアガロースゲルにロードします。サイズベースのフラグメント分離のために電気泳動を実行します。

ゲルを酸性溶液で処理してプリン塩基を除去し、二本鎖DNA、dsDNAを緩めます。アルカリ変性溶液を加えます。高いpHは水素結合を破壊し、緩んだdsDNAを一本鎖DNA、ssDNAに変性させます。中和溶液とインキュベートしてゲルpHを中和します。

あぶらとり紙、ナイロンメンブレン、およびメンブレンの上に重ねられたゲルを使用して、転写システムを組み立てます。転送を実行します。ssDNAは、下向きの毛細管現象を介してゲルから膜に移動します。

膜に紫外線を照射し、DNAを架橋して固定します。ハイブリダイゼーション溶液の入ったチューブにメンブレンを入れます。回転しながらインキュベートし、膜をコーティングし、非特異的なプローブ結合を防ぎます。

最後に、一本鎖放射性標識プローブを含むハイブリダイゼーションバッファーでメンブレンをインキュベートします。プローブは、配列の相補性を介して特定のDNA領域に結合します。

メンブレンを洗浄し、結合していないプローブを取り除きます。メンブレンをX線にさらします。膜上の明確なバンドは、HRイベントを含むDNA領域とコントロール領域を区別します。

各

gDNAについて、サンプルあたり30マイクロリットルのDra I用の10Xバッファー、3マイクロリットルのDra I、および10マイクログラムのgDNAを混合します。最終容量が30マイクロリットルになるまで水を加え、摂氏37度で一晩インキュベートしてgDNAを消化します。

臭化エチジウムを含む1%アガロース電気泳動ゲルを調製します。以前に取得したサンプルを1 Kbのはしごとともにゲルにロードし、30〜40ボルトで一晩実行します。翌日、0.2ニュートンの塩酸溶液を入れたトレイにゲルを浸します。シェーカーを使用して、室温で20分間トレイを軽く振ってください。

ゲルをDNA変性溶液の入ったトレイに移します。室温で20分間軽く振ってください。次に、ゲルをDNA中和液の入ったトレイに移し、室温で20分間穏やかに振とう。急速な下向き転写システムを使用して、DNAをゲルからメンブレンに転写します。

次に、製造元が提供する説明書に記載されているように、TurboBlotter とブロッティング スタックを組み立てます。この後、メンブレンを取り出し、2X生理食塩水-クエン酸ナトリウムで1分間洗浄します。液体を組織で