ノーザンブロットは、植物組織の全RNA抽出物中の特定のマイクロRNAを検出し、定量します。

マイクロRNA、miRNAは、小さな一本鎖のノンコーディングRNAです。miRNAはマルチタンパク質複合体に組み込まれ、さらに相補的な標的mRNA配列に結合して遺伝子発現を負に調節します。

植物組織のトータルRNAから特定のmiRNAを検出するには、追跡色素とRNA変性剤であるホルムアミドを含むゲルローディング色素を追加します。電気泳動の前にサンプルを加熱してRNAを変性させ、二次構造の形成を防ぎます。

サンプルと標準RNAマーカーを、事前に組み立てられた変性ポリアクリルアミドゲルのウェルにロードします。電気泳動を実行し、RNAフラグメントのサイズベースの分離を容易

にします。

ゲルをエレクトロブロッティングカセット上のプレウェットフィルターペーパーに転写します。バッファーを浸したナイロンブロッティングメンブレンをゲルの上に整列させます。次に、事前に濡れた濾紙を積み重ねます。エレクトロブロッティングを実行します。

電流

により、miRNAを含む負に帯電したRNAがゲルから正に帯電したナイロン膜表面に移動します。膜を紫外線にさらします。これにより、RNAが膜に架橋され、RNAの損失が防止されます。

バックグラウンドノイズを低減するために、非特異的結合部位を占めるブロッキング剤を含むハイブリダイゼーションバッファーでメンブレンをインキュベートします。

標的miRNAに相補的な放射性標識RNAオリゴヌクレオチドプローブを添加して、標的miRNAに特異的に結合します。メンブレンをバッファーで洗浄し、結合していないプローブを取り除きます。

蛍光体イメージングシステムを使用して、放射性ハイブリダイゼーション信号強度を検出および定量します。高分解能シグナルは、植物組織における特異的なmiRNA発現を示します。

ゲルのプレランを停止します。

サンプルをロードする前にウェルを徹底的に洗浄し、ウェル内の尿素の堆積物を除去します。再懸濁したRNAサンプルを98度で1分間加熱します。キャピラリーチップを使用して、サンプルを高温でウェルにロードします。気泡の侵入を避けてください。

すべてのサンプルのロードを完了し、蓋を組み立てます。ゲルを80ボルトで3時間、またはブロモフェノールブルーが完全に流れるまで実行します。転写には正に帯電したナイロンメンブレンを使用してください。ガラス板の寸法にカットします。右上隅にメンブレンにラベルを付けます。滅菌ミリQ水の表面にメンブレンをそっと置きます。ラベル面を水面に向けて下向きにしてください。

清潔なトレイを取り、電気転写用のゲルサンドイッチを準備します。カセットの灰色の面を下に置きます。カセットのレベルより少し上に1X TBEを注ぎます。ファイバーパッドを1X TBEで事前に濡らし、絞って気泡を取り除きます。あぶらとり紙を2枚ファイバーパッドのサイズ