0 閲覧数 • 8:51 分 • July 8th, 2025
マイクロRNA、miRNAは、小さな一本鎖のノンコーディングRNAです。miRNAはマルチタンパク質複合体に組み込まれ、さらに相補的な標的mRNA配列に結合して遺伝子発現を負に調節します。
植物組織のトータルRNAから特定のmiRNAを検出するには、追跡色素とRNA変性剤であるホルムアミドを含むゲルローディング色素を追加します。電気泳動の前にサンプルを加熱してRNAを変性させ、二次構造の形成を防ぎます。
サンプルと標準RNAマーカーを、事前に組み立てられた変性ポリアクリルアミドゲルのウェルにロードします。電気泳動を実行し、RNAフラグメントのサイズベースの分離を容易
にします。ゲルをエレクトロブロッティングカセット上のプレウェットフィルターペーパーに転写します。バッファーを浸したナイロンブロッティングメンブレンをゲルの上に整列させます。次に、事前に濡れた濾紙を積み重ねます。エレクトロブロッティングを実行します。
電流により、miRNAを含む負に帯電したRNAがゲルから正に帯電したナイロン膜表面に移動します。膜を紫外線にさらします。これにより、RNAが膜に架橋され、RNAの損失が防止されます。
バックグラウンドノイズを低減するために、非特異的結合部位を占めるブロッキング剤を含むハイブリダイゼーションバッファーでメンブレンをインキュベートします。
標的miRNAに相補的な放射性標識RNAオリゴヌクレオチドプローブを添加して、標的miRNAに特異的に結合します。メンブレンをバッファーで洗浄し、結合していないプローブを取り除きます。
蛍光体イメージングシステムを使用して、放射性ハイブリダイゼーション信号強度を検出および定量します。高分解能シグナルは、植物組織における特異的なmiRNA発現を示します。
ゲルのプレランを停止します。
サンプルをロードする前にウェルを徹底的に洗浄し、ウェル内の尿素の堆積物を除去します。再懸濁したRNAサンプルを98度で1分間加熱します。キャピラリーチップを使用して、サンプルを高温でウェルにロードします。気泡の侵入を避けてください。
すべてのサンプルのロードを完了し、蓋を組み立てます。ゲルを80ボルトで3時間、またはブロモフェノールブルーが完全に流れるまで実行します。転写には正に帯電したナイロンメンブレンを使用してください。ガラス板の寸法にカットします。右上隅にメンブレンにラベルを付けます。滅菌ミリQ水の表面にメンブレンをそっと置きます。ラベル面を水面に向けて下向きにしてください。
清潔なトレイを取り、電気転写用のゲルサンドイッチを準備します。カセットの灰色の面を下に置きます。カセットのレベルより少し上に1X TBEを注ぎます。ファイバーパッドを1X TBEで事前に濡らし、絞って気泡を取り除きます。あぶらとり紙を2枚ファイバーパッドのサイズにカットします。
あぶらとり紙を1X TBEで事前に濡らし、ファイバーパッドの上に置きます。プラスチック製のピペットを紙の上で転がして気泡を取り除きます。別のあぶらとり紙を1つの1X TBEに事前に濡らし、カセットの上に置きます。気泡を取り除くためにロールオーバーします。これで、サンドイッチのセットアップは電気転写の準備が整いました。
電気泳動が完了したら、実行を停止し、装置から蓋を取り外します。実行中のカセットをセットアップから取り外します。ランニングカセットからガラス板を取り出します。
アセンブリからゲルを慎重に取り外します。最初にロードされたRNAサンプルが右側になるように、あぶらとり紙の上に置きます。あらかじめ浸したメンブレンを1X TBEにそっと浸し、ラベル面を下にしてゲルの上に置きます。メンブレンとゲルを乾燥させないでください。気泡を取り除くために、そっと転がします。
あぶらとり紙1枚を1X TBEに浸し、メンブレンの上に置きます。気泡を取り除きます。別のあぶらとり紙を置き、気泡を取り除きます。ファイバーパッドをアセンブリの上に置いてサンドイッチを完成させます。カセットをしっかりと閉じます。
トランスブロットカセットをモジュールに配置します。タンクに1X TBE、pH 8.2をブロッティングマークまで充填します。装置の蓋を閉め、10 ボルトで 4 度で一晩、または冷蔵室で移送します。UV架橋剤を準備し、電気転写が完了する直前に1,200に設定してください。
転送が完了したら、モジュールからカセットを取り外します。湿らせたメンブレンをA4用紙に置き、マークされた面を上にします。120ミリジュールの254ナノメートルのUV光を照射することにより、RNAを膜に架橋します。架橋ブロットは、4度で保存するか、ハイブリダイゼーションに使用できます。
検出する必要がある低分子RNAと完全に相補的なプローブを設計し、PNK酵素を使用してプローブの5プライム末端に標識し、図のように成分を組み合わせます。反応混合物を37度で30分間インキュベートします。
30分間のインキュベーション後、G-25カラムを使用して、反応混合物から標識されていないプローブを分離します。プローブの標識を改善するには、使用前にG-25カラムを準備してください。ブロットをRNA側を上に向けてハイブリダイゼーションボトルに入れます。使用前にハイブリダイゼーションバッファーを激しく混合してください。10mlのハイブリダイゼーションバッファーを加え、ハイブリダイゼーションボトルを35度に保ちながら回転させたハイブリダイゼーションオーブンに入れます。
20〜30分間プレハイブリダイゼーションを実行します。プレハイブリダイゼーション後、ボトルをオーブンから取り出します。標識プローブをハイブリダイゼーションバッファーに穏やかに加えます。気泡が発生していないことを確認してください。ブロットをオーブン内で35度で12時間回転させてインキュベートします。
ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイゼーションバッファーをボトルから取り出します。洗浄バッファーIを使用してブロットのクイック洗浄を実行します。このステップは、ブロットから余分なハイブリダイゼーション溶液を除去するために実行されます。さらに、洗浄バッファーIを使用してブロットを35度で30分間インキュベートします。バッファーIIを使用して35度で30分間再度洗浄します。
ブロットを洗い流した後、ハイブリダイゼーションカバーの中に入れ、余分なバッファーを取り除き、密封します。カセットに入れ、放射線のない蛍光体イメージャースクリーンに12時間さらします。Typhoon Biomolecular Imagerを使用してハイブリダイゼーションシグナルを検出し、ImageJソフトウェアを使用して結果を解析します。