トランスフェクション細胞における酵素受容体相互作用を研究するための免疫沈降アッセイ

細胞表面受容体タンパク質であるプログラム死-1、PD-1には、阻害モチーフであるITIMとスイッチモチーフであるITSMの2つの細胞質チロシンモチーフが含まれています。リガンド結合は、ITIMおよびITSMリン酸化およびチロシンホスファターゼタンパク質SHP2のPD-1の細胞質ドメインへの動員を誘導し、下流のシグナル伝達カスケードを引き起こします。

共免疫沈降アッセイを介してSHP2-PD-1相互作用を研究するには、接着性上皮細胞培養物を取得します。これらの細胞は、リン酸化ITIMおよびITSMを持つGFPタグ付き野生型PD-1である緑色蛍光タンパク質を発現します。GFPタグ付き変異体PD-1を発現する上皮細胞を入手し、ITIMまたはITSM変異がそれらのリン酸化を阻害します。

界面活性剤とオルトバナジン酸ナトリウムを含む溶解バッファーを加えます。界面活性剤は細胞を溶解し、GFP タグ付き PD-1 タンパク質の放出を引き起こします。オルトバナジン酸ナトリウムはホスファターゼをブロックし、ITIMおよびITSMの脱リン酸化を防ぎます。

ライセートを遠心分離します。タンパク質含有上清を新鮮なチューブに移します。抗GFP抗体でコーティングされたアガロースビーズを追加します。GFPタグ付きPD-1タンパク質は、抗GFP抗体に結合します。

SHP2懸濁液でインキュベートします。ビーズ結合PD-1-GFPは、リン酸化ITIMおよびITSMを介してSHP2に結合します。

Laemmliバッファーを加えて沸騰させ、バッファー中の還元剤と界面活性剤がPD-1-GFP-SHP2タンパク質複合体を変性させます。変性タンパク質複合体を含む上清を遠心分離して回収します。SDS-PAGEとウェスタンブロットを実行します。

野生型およびITIM変異PD-1はSHP2と相互作用します。ITSM変異体はSHP2に結合できず、PD1-SHP2相互作用がリン酸化ITSMを必要とすることを示しています。

免疫沈降を実行する間、すべてのステップは氷の上または摂氏4度で実行する必要があります。阻害剤1錠を10ミリリットルの緩衝液に溶解することにより、溶解緩衝液にプロテアーゼ阻害剤を補充します。また、PD1-GFPトランスフェクトプレートに使用するバッファーに1ミリモルのオルトバナジン酸ナトリウムを加えます。500マイクロリットルの氷冷溶解バッファーを細胞に加え、オルトバナジン酸ナトリウムを含む溶解バッファーをPD1-GFPトランスフェクト細胞を含むプレートのみに必ず添加します。

セルスクレーパーを使用して、プレートから細胞をすぐに取り除き、収集します。ライセートを1.5ミリリットルのコールドチューブに移し、0.005倍g、摂氏4度で30分間回転させます。溶解物から核後上清を回収するには、それらを10,000倍gと摂氏4度で10分間回転させます。

上清を新しいチューブに移し、ペレットを廃棄します。後のWCL分析のために、6枚のプレートの2番目のセットの上清を氷上に保存します。

抗GFPビーズの調製を開始するには、沈殿を防ぐために、開封前にビーズの入ったボトルを軽く振ってください。各条件ごとにスラリーから40マイクロリットルの抗GFPビーズを除去します。500倍g、摂氏4度で3分間遠心分離します。上清を取り除いてビーズを洗浄し、紛失を防ぐためにピペットとビーズの接触を最小限に抑えます。

ビーズをサンプルあたり80マイクロリットルの溶解バッファーに再懸濁します。洗浄したビーズを、最初の4つのプレートセットのPD1-GFP発現細胞からの細胞ライセートに直接加えます。摂氏4度で30分間0.005回gで回転させ、GFPタグ付きタンパク質を免疫沈降させます。洗浄ごとに、オルトバナジン酸塩を含まない1ミリリットルの低温溶解バッファーを使用して、ビーズを3回洗浄します。次に、2,500倍gで10秒間遠心分離します。

プレートの最初のセットからの活性SHP2のライセートを3等分し、洗浄したPD1-GFP含有ビーズを含む3つのチューブのそれぞれに一部を追加します。トランスフェクトされていない細胞からのライセート体積の1/3を野生型PD1-GFPビーズの2番目のチューブに加えます。残りの2/3は捨てます。

ビーズを摂氏4度で4時間インキュベートし、0.005回gで穏やかに回転させます。この後、洗浄ごとに1ミリリットルのコールド溶解バッファーを使用して、ビーズを2回洗浄します。各サンプルに 80 マイクロリットルの溶解バッファーを加え、各チューブの総容量が 100 マイクロリットルになるようにします。カットしたピペットチップを使用して、ピペットをゆっくりと上下にピペットで混ぜます。次に、各チューブから 50 マイクロリットルを 2 つの新鮮な 1.5 ミリリットルのチューブに移します。

まず、ビーズを2,000倍g、摂氏4度で30秒間回転させ、上清を取り除きます。20マイクロリットルの2x Laemmliバッファーを加え、摂氏95度で5分間沸騰させます。BCAキットを使用して、入力コントロールのタンパク質濃度を測定します。

最も希釈されたサンプル30マイクロリットルを新しいチューブに移します。溶解バッファーを使用して、残りの入力コントロールを最も希釈したサンプルと同じ濃度に希釈します。次に、希釈した各入力コントロールの30マイクロリットルを新しいチューブに移します。同量の2x Laemmliバッファーを溶解物に加え、摂氏95度で5分間沸騰させます。

この後、ビーズを2,000倍g、摂氏4度で30秒間スピンダウンしてから、テキストプロトコルに概説されているようにウェスタンブロット分析を実行します。