トランスフェクション細胞における酵素受容体相互作用を研究するための免疫沈降アッセイ

細胞表面受容体タンパク質であるプログラム死-1、PD-1には、阻害モチーフであるITIMとスイッチモチーフであるITSMの2つの細胞質チロシンモチーフが含まれています。リガンド結合は、ITIMおよびITSMリン酸化およびチロシンホスファターゼタンパク質SHP2のPD-1の細胞質ドメインへの動員を誘導し、下流のシグナル伝達カスケードを引き起こします。

共免疫沈降アッセイを介してSHP2-PD-1相互作用を研究するには、接着性上皮細胞培養物を取得します。これらの細胞は、リン酸化ITIMおよびITSMを持つGFPタグ付き野生型PD-1である緑色蛍光タンパク質を発現します。GFPタグ付き変異体PD-1を発現する上皮細胞を入手し、ITIMまたはITSM変異がそれらのリン酸化を阻害します。

界面活性剤とオルトバナジン酸ナトリウムを含む溶解バッファーを加えます。界面活性剤は細胞を溶解し、GFP タグ付き PD-1 タンパク質の放出を引き起こします。オルトバナジン酸ナトリウムはホスファターゼをブロックし、ITIMおよびITSMの脱リン酸化を防ぎます。

ライセートを遠心分離します。タンパク質含有上清を新鮮なチューブに移します。抗GFP抗体でコーティングされたアガロースビーズを追加します。GFPタグ付きPD-1タンパク質は、抗GFP抗体に結合します。

SHP2懸濁液でインキュベートします。ビーズ結合PD-1-GFPは、リン酸化ITIMおよびITSMを介してSHP2に結合します。

Laemmliバッファーを加えて沸騰させ、バッファー中の還元剤と界面活性剤がPD-1-GFP-SHP2タンパク質複合体を変性させます。変性タンパク質複合体を含む上清を遠心分離して回収します。SDS-PAGEとウェスタンブロットを実行します。

野生型およびITIM変異PD-1はSHP2と相互作用します。ITSM変異体はSHP2に結合できず、PD1-SHP2相互作用がリン酸化ITSMを必要とすることを示しています。

免疫沈降を実行する間、すべてのステップは氷の上または摂氏4度で実行する必要があります。阻害剤1錠を10ミリリットルの緩衝液に溶解することにより、溶解緩衝液にプロテアーゼ阻害剤を補充します。また、PD1-GFPトランスフェクトプレートに使用するバッファーに1ミリモルのオルトバナジン酸ナトリウムを加えます。500マイクロリットルの氷冷溶解バッファーを細胞に加え、オルトバナジン酸ナトリウムを含む溶解バッファーをPD1-GFPトランスフェクト細胞を含むプレートのみに必ず添加します。

セルスクレーパーを使用して、プレートから細胞をすぐに取り除き、収集します。ライセートを1.5ミリリットルのコールドチューブに移し、0.005倍g、摂氏4度で30分間回転させます。溶解物から核後上清を回収するには、それらを10